Rezultate
Structuri de R96A GFPsol Varianta Înainte și După Peptide Ciclizare. Pentru că R96 a fost propus sa fie activa S65 carbonil pentru atac nucleofil (20) sau direct deprotona la G67 vertebrală amide (22), pe care am construit-o R96A variantă și a descoperit că acest punct de mutație încetinește reacția de ciclizare de la minute la luni., După purificare a început incolor R96A proteine, cromofor de maturare s-a realizat prin incubarea timp de 3 luni la temperatura de 37°C. Nostru 1.50-Å rezolutie cristalografice structură a ajuns la scadență, R96A proteine (Tabelul 1) este foarte similară cu cea de solubilitatea sa-optimizat GFPsol părinte, cu un ansamblu de Ac rms abatere de 0.20 Å. În GFP, R96 formează o legătură de hidrogen cu oxigenul imidazolon al cromoforului Matur. În R96A mutant, trei molecule de apă umple volumul ocupat în mod normal de către R96 lanț lateral, dar nu reușesc să formeze legături de hidrogen cu imidazolone oxigen., Acest lucru poate explica schimbările în fluorescență maxima pentru R96A variant (468 nm excitație, 503-nm emisie), comparativ cu GFPsol (489-nm excitație, 508 nm emisie), sugerând că R96 scade entuziasmat de stat de energie de cromofor, în concordanță cu rezultate nepublicate pe R96C variant (4). Foarte important, cromoforul variantei R96A este complet maturat (Fig. 1A), demonstrând că acest mutant păstrează toate componentele esențiale pentru formarea cromoforului.
modificări Posttranslaționale relevate de structurile variantelor GFP înainte și după ciclizarea coloanei vertebrale. Omit| Fo-Fc / hărți ale densității electronilor pentru reziduurile de cromofor conturate la 3 σ (negru). (a) structura R96a ciclizată de 1,50 Å. (b)structura intermediară de preciclizare R96a de 2,00 Å. (c) structura intermediară B de preciclizare R96a de 2,00 Å. (D și e) vederi ortogonale ale structurii postciclizare oxidate aerobe 1.80-Å Gly-Gly-Gly. (f) structura moleculară propusă a inelului Ciclizat Gly-Gly-Gly. (g) structura de preciclizare anaerobă 1.80-Å Gly-Gly-Gly., Toate sunt ilustrate inraster 3d (44).
- vezi inline
- vezi pop-up
Am folosit lent rata de maturare a R96A varianta de a izola GFP intermediari înainte de ciclizare și se determină astfel două independente cristalografice structuri (Tabelul 1) de GFP înainte posttranslational de modificări (Fig. 1 b și c)., În mecanică de compresie ipoteza, sterice interacțiunile generate de GFP arhitectura sunt propuse pentru a ridica energia precyclization stat mai presus de cea a cyclized intermediare și relaxantă acest tensionate conformație conduce cromofor formarea. Astfel, am examinat structurile de preciclizare R96A cu rezoluție 2.0 Å pentru evidențierea interacțiunilor sterice care ar putea fi relaxate la formarea cromoforului. În schimb, densitatea electronică relevă conformații favorabile pentru reziduurile de cromofor, fără coliziuni semnificative ale van der Waals., În afara reziduurilor de cromofor, cele două structuri sunt foarte asemănătoare (Fig. 2a). Atomii de Ca se suprapun cu o abatere rms de 0,28 Å, iar rearanjamentele conformaționale ale lanțului lateral sunt minore. Interesant este că aceste structuri determinate independent prezintă conformații distincte ale lanțului lateral Y66, situate de o parte și de alta a celui de-al patrulea fir β (Fig. 1 b și c). Fiecare stive cu Q94 și ocupă o parte din cavitatea creată prin trunchierea R96. Cristalele utilizate pentru a determina aceste structuri intermediare de preciclizare diferite au crescut în aceleași condiții., Astfel, ne propunem ca proteina are isoenergetic membre pentru Y66 cu low interconversia barierelor de energie și că subtile de cristal ambalare diferențe pot propaga la proteina de bază pentru a selecta observat conformații.
distorsiuni arhitecturale și comparații structurale între stările de preciclizare și postciclizare. (a) Suprapunerea a R96A structuri, subliniind mare modificare conformațională pentru Y66 dar în caz contrar mici Ca diferențe între precyclization (în galben, B în albastru) și postcyclization (verde) membre., (b) helix Central pentru trei structuri R96A afișate cu suprafața structurii mature R96A, subliniind curbura elicoidală. (c) Structurale suprapunere de R96A precyclization intermediari-O (galben) și B (albastru) cu mature R96A (verde) structura, arată principal mare lanț de mișcări în formarea cromofor. Modelat R96 (violet) indică steric interacțiuni cu Y66 lant de poziția precyclization structură intermediară., (d) suprapunerea structurilor Gly-Gly-Gly înainte (albastru, anaerob) și după ciclizarea peptidelor (verde, aerobe) prezintă interacțiuni de grup funcțional între atomii de oxigen carbonil R96, E222 și T62 și reziduurile de cromofor. (e) schematică a distorsiunilor în interacțiunile de legare a hidrogenului cu lanț principal pentru structurile WT, Gly-Gly-Gly și postcyclization (stânga) afișate în comparație cu o α-helix canonică (dreapta). Liniile solide dintre atomii lanțului principal indică prezența unei legături de hidrogen. a-d sunt ilustrate cu avs (45).,
Comparații ale precyclization și mature cromofor membre pentru R96A structuri identifica atât global, cât și local, caracteristici care conduc peptide ciclizare. În ciuda dramatice propuneri de cromofor-formarea de reziduuri, în care Y66 fenolici atom de oxigen se mută 14 Å și coloana vertebrală atomi de schimbare de 2.6 3.1 Å, reziduuri afara de cromofor suprapune bine de trei R96A structuri (Fig. 2a). Cromoforul este ancorat atât de reziduurile hidrofobe adiacente, cât și de interacțiunile hidrofobe la capetele helixului distorsionat central (Fig. 2b)., Într-o secvență de aliniere de 48 GFP omologii (Tabelul 2, care este publicat în sprijinirea informații cu privire la PNAS site-ul web, www.pnas.org), reziduuri de 64 de ani, care precede imediat cromofor, este în esență un hidrofobe (41 secvențe; F, L, V) sau cisteina (6 secvențe) reziduuri. Interesant este că toate secvențele care conțin C64 conțin și C29. Cartografierea acestor reziduuri de cisteină pe structura GFP (datele nu sunt prezentate) le plasează într-o orientare rezonabilă pentru a forma o legătură disulfidică și pentru a oferi o metodă alternativă de ancorare (la interacțiunile hidrofobe)., Mai mult decât atât, în ciuda dreptaci elicoidale conformații într-un teren Ramachandran, reziduurile de acest distorsionat „helix” în mature GFP face doar trei principale-lanț de legături de hidrogen, între reziduuri perechi L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), și V68-F71 (310-helix). La R96A precyclization structuri adauga T62-Y66 (α-helix) și S65T-V68 (310-helix) legături de hidrogen. Astfel, majoritatea distorsiunilor din helixul central nu sunt o consecință a formării cromoforului, ci mai degrabă sunt impuse de schela proteică., În toate structurile GFP (1, 17) și ale omologilor săi de proteine fluorescente roșii (35, 36), o curbă dramatică ≈80° în helix (Fig. 2B), generată de arhitectura proteică, este focalizată pe cromofor (Fig. 2c). Severe îndoiți expune T62 și Y66 carbonil atomi de oxigen pentru interacțiunile cu R96 (a se vedea mai jos) și forțele G67 azot nucleofil și S65T carbonil de oxigen în contact mai apropiat (3.0 si 3.2 Å în două precyclization structuri) decât suma (3.25 Å) a lor van der Waals (37), în curs de pregătire pentru formarea legăturii covalente în peptide ciclizare (Fig. 2c)., În mod semnificativ, aceste distorsiuni elimină legăturile potențiale de hidrogen elicoidal care altfel ar trebui rupte la un cost energetic în timpul ciclizării. Împreună, structurile R96A sugerează că arhitectura GFP impune distorsiuni destabilizatoare, împiedicând o conformație α-elicoidală stabilă și creând o stare mai aproape de starea de tranziție pentru ciclizarea peptidelor., Acest lucru este analog la entatic de stat propunere de metaloproteine (38), în care schele de proteine constrânge un metal center într-un destabilizat geometrice conformație a reduce reorganizare barierelor de energie și de a crește ratele de reacție.
structuri ale variantei S65G Y66G în condiții aerobe și anaerobe. Să se examineze dacă lant de interactiuni de cromofor reziduuri sunt critice pentru coloana vertebrală ciclizare, am construit și caracterizat incolor S65G Y66G variant (secvență Gly-Gly-Gly pentru cromofor reziduuri)., Mutatii rezultatele au stabilit că aproape orice substituție pentru S65, substituții aromatice pentru Y66, și WT G67 formă matură chromophores (4). Cu toate acestea, dacă mecanice de compresie model pentru peptide ciclizare (20) sau propunerea ca parte a lanțului de oxidare este necesară înainte de ciclizare (22) au fost corecte, trunchiere la Gly-Gly-Gly variantă ar trebui să împiedice sau să împiedice coloana vertebrală ciclizare. În mod remarcabil, densitatea electronică pentru o structură de rezoluție de 1,80 Å a acestei variante (Tabelul 1) arată că coloana vertebrală este ciclizată., Hărți simulate de omitere a recoacerii pentru această variantă ciclizată Gly-Gly-Gly (Fig. 1 d și e) arată că imidazolone inelul este mutat ≈0.7 Å de poziția sa în GFPsol structura și modificate de două nonhydrogen atomi. Primul atom, oxigenul carbonil s65g, nu a fost pierdut ca apă, așa cum este cazul WT GFP. În schimb, acest oxigen rămâne atașat la inelul imidazolonei și formează o legătură de hidrogen cu lanțul lateral al E222 (Fig. 2D)., Cel de-al doilea nonhydrogen atom este legat covalent la Y66G Ca de cyclized inel și este cel mai probabil un atom de oxigen încorporate printr-o reacție de oxidare (a se vedea Fig. 4, care este publicat ca informații justificative pe site-ul web PNAS, pentru mecanismul propus). Am confirmat că vârfurile suplimentare din hărțile omit erau reale și nu erau derivate din varianta proteică prin resecvenția plasmidei, purificarea unui al doilea lot de proteine, rezolvarea unei a doua structuri de 2,00 Å și observarea acelorași vârfuri în noile hărți omit. Densitatea electronilor (Fig., 1d) este în concordanță cu cinci electroni π -, nonaromatic inel de sistem care conține un tetraedrice S65G carbonil atom de carbon (puckering în cyclized inel), un enol tautomer pentru Y66G carbonil și o keto tautomer pentru nou-constituite atom de oxigen (Fig. 1F). Ciclizarea Gly-Gly-Gly, care nu conține atomi cu lanț lateral, argumentează împotriva modelului propus în care oxidarea lanțului lateral precede ciclizarea (22).
Ne-am pregătit și cristalizat S65G Y66G varianta în condiții anaerobe pentru a explora neașteptate încorporare de oxigen la Y66G Ca., În mod surprinzător, structura anaerobă la rezoluția 1.80-Å (Tabelul 1) a evidențiat reziduuri de cromofor neciclizate (Fig. 1g). În afara cromoforului, structurile Gly-Gly-Gly-Gly de preciclizare și postciclizare sunt remarcabile similare (Fig . 2D) și împărțiți cu WT GFP aceeași legătură limitată de hidrogen (6 din 24 posibile interacțiuni cu lanț principal) pentru helixul central (Fig. 2e). Astfel, chiar și flexibilitatea suplimentară a coloanei vertebrale conferită de înlocuirea Gly pentru aminoacizii cromofori nu are ca rezultat formarea de legături suplimentare de hidrogen cu catenă principală., Lipsa de main-lanț de legături de hidrogen pentru cromofor reziduuri contribuie la aparente reduse interconversia barierelor de energie și de mare locale rearanjamente pentru ciclizare observate în R96A structuri (de mai sus). Distorsiunile în starea de preciclizare sunt menținute în starea de postciclizare, mai degrabă decât ameliorate prin formarea cromoforului. Aceasta susține ipoteza compresiei mecanice, dar subliniază importanța arhitecturii GFP în crearea unei conformații specifice care favorizează ciclizarea peptidelor.,rezultatele structurale Gly-Gly-Gly dezvăluie caracteristici conformaționale și energetice critice pentru ciclizarea peptidelor. Standard principală a lanțului de conformații pentru G67 în ambele precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) și postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) membre sugerează că aparenta cerință pentru G67 în cromofor formarea (4) rezultate din steric mai degrabă decât conformaționale restricții. De fapt, un lanț lateral Ala modelat pentru reziduul 67 are coliziuni semnificative van der Waals cu oxigenul carbonil T63., Mai important, eșecul secvenței Gly-Gly-Gly de a cicliza anaerob indică faptul că ciclizarea în acest mutant este cuplată la oxidare. Lipsa de orice parțială de ocupare a unui cyclized produs în condiții anaerobe sugerează că precyclization structura este din punct de vedere termodinamic mai stabil decât un cyclized dar încă nu a oxidat de stat., Astfel, oxidarea servește la creșterea conjugării electronice a variantei Gly-Gly-Gly și la capcana unui produs de ciclizare nefavorabil termodinamic conform principiului lui Le Chatelier ca specie nonaromatică stabilizată prin rezonanță, cu cinci π-electroni.