resultados
estructuras de la variante R96a GFPsol antes y después de la Ciclización peptídica. Debido a que se ha propuesto que R96 active el carbonilo S65 para un ataque nucleofílico (20) o desprotone directamente la amida troncal G67 (22), construimos una variante R96A y descubrimos que esta mutación puntual ralentiza la reacción de ciclización de minutos a meses., Después de la purificación de la proteína r96a inicialmente incolora, la maduración del cromóforo se logró mediante incubación durante 3 meses a 37°C. nuestra estructura cristalográfica de 1,50 Å de resolución de esta proteína r96a madura (Tabla 1) es muy similar a la de su padre gfpsol optimizado para solubilidad, con una desviación general de Ca rms de 0,20 Å. En GFP, R96 forma un enlace de hidrógeno con el oxígeno de imidazolona del cromóforo maduro. En el mutante R96A, tres moléculas de agua llenan el volumen normalmente ocupado por la cadena lateral R96, pero no forman enlaces de hidrógeno con el oxígeno de imidazolona., Esto puede explicar los cambios en los máximos de fluorescencia para la variante R96A (excitación de 468 nm, emisión de 503 nm) en comparación con GFPsol (excitación de 489 nm, emisión de 508 nm), lo que sugiere que R96 reduce la energía del estado excitado del cromóforo, en consonancia con los resultados no publicados en la variante R96C (4). Es importante destacar que el cromóforo de la variante R96A está completamente maduro (Fig. 1a), demostrando que este mutante retiene todos los componentes esenciales para la formación de cromóforos.
modificaciones postraduccionales reveladas por estructuras de variantes de GFP antes y después de la ciclación de la columna vertebral. Omitir| Fo-Fc / mapas de densidad electrónica para los residuos cromóforos contorneados a 3 σ (negro). (a) El 1.50-Å cicla R96A estructura. (b) La estructura intermedia a de preciclización R96a de 2.00-Å. (c) la estructura B intermedia r96a de precyclización 2.00-Å. (d and e) Orthogonal views of the 1.80-Å Gly-Gly-Gly aerobic oxidized postcyclization structure. f) estructura molecular propuesta del anillo Ciclizado Gly-Gly-Gly. g) la estructura de precyclización anaeróbica de 1,80-Å Gly-Gly-Gly., Todos están ilustrados inraster 3d (44).
- Ver en línea
- Ver popup
se utilizó la tasa de maduración lenta de la variante R96A para aislar los intermedios de GFP antes de la ciclización y así determinar dos estructuras cristalográficas independientes (Tabla 1) de GFP antes de las modificaciones postraduccionales (Fig. 1 b y c)., En la hipótesis de compresión mecánica, las interacciones estéricas generadas por la arquitectura GFP se proponen para elevar la energía del Estado de precyclización por encima de la del intermedio ciclizado y relajar esta conformación tensa impulsa la formación de cromóforos. Por lo tanto, examinamos las estructuras de preciclización r96a de resolución 2.0-Å para la evidencia de interacciones estéricas que podrían ser relajadas en la formación de cromóforos. En cambio, la densidad electrónica revela conformaciones favorables para los residuos cromóforos sin colisiones significativas de van der Waals., Fuera de los residuos cromóforos, las dos estructuras son muy similares (Fig. 2a). Los átomos de Ca se superponen con una desviación rms de 0,28 Å, y los reordenamientos conformacionales de la cadena lateral son menores. Curiosamente, estas estructuras determinadas independientemente exhiben distintas conformaciones de la cadena lateral Y66, que se encuentran a cada lado de la cuarta hebra β (Fig. 1 b y c). Cada pila con Q94 ocupa parte de la cavidad creada truncando R96. Los cristales utilizados para determinar estas diferentes estructuras intermedias de preciclización crecieron en las mismas condiciones., Por lo tanto, proponemos que la proteína posee Estados isoenergéticos para Y66 con barreras energéticas de baja interconversión y que las diferencias sutiles de empaquetamiento de cristales pueden propagarse al núcleo de la proteína para seleccionar las conformaciones observadas.
distorsiones arquitectónicas y comparaciones estructurales entre estados de preciclización y postciclización. (a) Superposición de estructuras R96A, enfatizando un gran cambio conformacional para Y66 pero por lo demás pequeñas diferencias Ca entre los estados de precyclización (a en amarillo, B en azul) y postciclización (Verde)., (b) hélice Central para tres estructuras r96a mostradas con la superficie de la estructura madura R96A, enfatizando la curva helicoidal. (c) superposición estructural de los intermedios de precyclización R96A a (amarillo) y B (azul) con la estructura madura R96A (Verde), mostrando grandes movimientos de la cadena principal en la formación del cromóforo. El modelo R96 (púrpura) indica interacciones estéricas con la posición de la cadena lateral Y66 de la estructura intermedia de precyclización., D) la superposición de las estructuras Gly-Gly-Gly antes (azul, anaeróbica) y después (Verde, aeróbica) de la ciclación peptídica muestra interacciones de grupos funcionales entre los átomos de carbonilo oxigenado R96, E222 y T62 y los residuos cromóforos. (e) esquema de las distorsiones en las interacciones de enlace de hidrógeno de la cadena principal para las estructuras WT, Gly-Gly-Gly precyclization y postcyclization (izquierda) mostradas en comparación con una α-hélice canónica (derecha). Las líneas sólidas entre los átomos de la cadena principal indican la presencia de un enlace de hidrógeno. a-d se ilustran con avs (45).,
Las comparaciones de la precyclización y los Estados cromóforos maduros para las estructuras R96A identifican características globales y locales que impulsan la ciclización peptídica. A pesar de los movimientos dramáticos de los residuos formadores de cromóforos, en los que el átomo fenólico de oxígeno Y66 se mueve 14 Å y los átomos troncales se desplazan 2.6–3.1 Å, los residuos fuera del cromóforo se superponen bien para las tres estructuras R96A (Fig. 2a). El cromóforo está anclado tanto por residuos hidrofóbicos adyacentes como por interacciones hidrofóbicas en los extremos de la hélice Central distorsionada (Fig. 2b)., En una alineación secuencial de 48 homólogos de GFP (Cuadro 2, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS, www.pnas.org), el residuo 64, que precede inmediatamente al cromóforo, es esencialmente un residuo hidrofóbico (41 secuencias; F, L, V) o cisteína (6 secuencias). Curiosamente, todas las secuencias que contienen C64 también contienen C29. El mapeo de estos residuos de cisteína en la estructura GFP (datos no mostrados) los coloca en una orientación razonable para formar un enlace disulfuro y proporcionar un método de anclaje alternativo (a interacciones hidrofóbicas)., Por otra parte, a pesar de las conformaciones helicoidales diestras en una gráfica de Ramachandran, los residuos de esta «hélice» distorsionada en GFP madura hacen solo tres enlaces de hidrógeno de la cadena principal, entre los pares de residuos L60-L64 (α-hélice), V61-S65T (α-hélice), y V68-F71 (310-hélice). Las estructuras de precyclización r96a añaden los enlaces de hidrógeno T62-Y66 (α-hélice) y S65T-V68 (310-hélice). Por lo tanto, la mayoría de las distorsiones en la hélice central no son una consecuencia de la formación de cromóforos, sino que son impuestas por el andamio de proteínas., En todas las estructuras de GFP (1, 17) y sus homólogos de proteína fluorescente roja (35, 36) una curva dramática ≈80° en la hélice (Fig. 2b), generado por la arquitectura de la proteína, se centra en el cromóforo (Fig. 2c). La curva severa expone los átomos de oxígeno carbonílico T62 e Y66 para interacciones con R96 (ver más abajo) y fuerza al nucleófilo de nitrógeno G67 y al oxígeno carbonílico s65t a un contacto más cercano (3.0 y 3.2 Å en las dos estructuras de precyclización) que la suma (3.25 Å) de sus radios de van der Waals (37), en preparación para la formación de enlaces covalentes durante la ciclización peptídica (Fig. 2c)., Significativamente, estas distorsiones eliminan posibles enlaces helicoidales de hidrógeno que de otra manera tendrían que romperse a un costo energético durante la ciclización. Juntas, las estructuras R96A sugieren que la arquitectura GFP impone distorsiones desestabilizadoras, impidiendo una conformación α-helicoidal estable y creando un estado más cercano al estado de transición para la ciclización peptídica., Esto es análogo a la propuesta de estado entático para las metaloproteínas (38), en la que el andamio proteico restringe un centro metálico en una conformación geométrica desestabilizada para reducir las barreras energéticas de reorganización y aumentar las tasas de reacción.
estructuras de la variante S65G Y66g en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Para examinar si las interacciones de cadena lateral de los residuos de cromóforos son críticas para la ciclización de la columna vertebral, construimos y caracterizamos la variante incolora S65G Y66g (secuencia Gly-Gly-Gly para residuos de cromóforos)., Los resultados mutacionales han establecido que casi cualquier sustitución para S65, sustituciones aromáticas para Y66, y el WT G67 forman cromóforos Maduros (4). Sin embargo, si el modelo de compresión mecánica para la ciclización peptídica (20) o la propuesta de que se requiere la oxidación de la cadena lateral antes de la ciclización (22) fueran correctos, el truncamiento a la variante Gly-Gly-Gly debería obstaculizar o impedir la ciclización de la columna vertebral. Sorprendentemente, la densidad electrónica para una estructura de resolución de 1,80 Å de esta variante (Tabla 1) revela que la columna vertebral está ciclada., El recocido simulado omite los mapas para esta variante ciclizada de Gly-Gly-Gly (Fig. 1 d y e) muestran que el anillo de imidazolona se desplaza ≈0.7 Å desde su posición en la estructura de GFPsol y se modifica por dos átomos no hidrogenados. El primer átomo, el s65g carbonyl oxygen, no se ha perdido como agua, como es el caso de WT GFP. En cambio, este oxígeno permanece unido al anillo de imidazolona y forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de E222 (Fig. 2d)., El segundo átomo no hidrogenado está covalentemente unido al Y66g Ca del anillo ciclizado y lo más probable es que sea un átomo de oxígeno incorporado a través de una reacción de oxidación (ver Fig. 4, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS, para el mecanismo propuesto). Confirmamos que los picos adicionales en nuestros mapas de omisión eran reales y no se derivaban de la variante de proteína al resecuenciar el plásmido, purificar un segundo lote de proteína, resolver una segunda estructura de 2.00-Å y observar los mismos picos en nuevos mapas de omisión. La densidad electrónica (Fig., 1d) es consistente con un sistema de anillo no aromático de cinco electrones π que contiene un átomo de carbono tetraédrico s65g carbonilo (frunciendo el anillo ciclizado), un tautómero enol para el carbonilo y66g, y un tautómero ceto para el átomo de oxígeno recién incorporado (Fig. 1f). La ciclización del Gly-Gly-Gly, que no contiene átomos de cadena lateral, argumenta en contra del modelo propuesto en el que la oxidación de la cadena lateral precede a la ciclización (22).
preparamos y cristalizamos la variante S65G y66g bajo condiciones anaeróbicas para explorar la incorporación inesperada de oxígeno en Y66g Ca., Sorprendentemente, la estructura anaeróbica a una resolución de 1.80-Å (Tabla 1) reveló residuos cromóforos no cíclicos (Fig. 1g). Fuera del cromóforo, las estructuras Gly-Gly-Gly de preciclización y postciclización son notablemente similares (Fig. 2d) y compartir con WT GFP el mismo enlace de hidrógeno limitado (6 de 24 posibles interacciones de la cadena principal) para la hélice central (Fig. 2e). Por lo tanto, incluso la flexibilidad adicional de la columna vertebral conferida por la sustitución de Gly para los aminoácidos cromóforos no resulta en la formación de enlaces de hidrógeno adicionales de la cadena principal., La falta de enlaces de hidrógeno de la cadena principal para los residuos de cromóforo contribuye a las barreras energéticas de interconversión aparentemente bajas y a los grandes reordenamientos locales para la ciclización observados en las estructuras r96a (arriba). Las distorsiones en el estado de preciclización se mantienen en el estado de postciclización, en lugar de aliviarse por la formación de cromóforos. Esto argumenta en contra de la hipótesis de compresión mecánica, pero subraya la importancia de la arquitectura GFP en la creación de una conformación específica que favorece la ciclización peptídica.,
los resultados estructurales Gly-Gly-Gly revelan características conformacionales y energéticas críticas para la ciclización peptídica. Las conformaciones estándar de la cadena principal para G67 en los estados de precyclización (Φ = -90°, Ψ = -16°) y postciclización (Φ = -90°, Ψ = -35°) sugieren que el requisito aparente para G67 en la formación de cromóforos (4) resulta de restricciones estéricas en lugar de conformacionales. De hecho, una cadena lateral de Ala modelada para el residuo 67 tiene colisiones significativas de van der Waals con el oxígeno carbonílico T63., Más importante aún, el fracaso de la secuencia Gly-Gly-Gly para ciclizar anaeróbicamente indica que la ciclización en este mutante está acoplada a la oxidación. La falta de ocupación parcial de un producto ciclizado bajo condiciones anaeróbicas sugiere que la estructura de precíclización es termodinámicamente más estable que un estado ciclizado pero aún no oxidado., Por lo tanto, la oxidación sirve para aumentar la conjugación Electrónica de la variante Gly-Gly-Gly y atrapar un producto de ciclización termodinámicamente desfavorable según el principio de Le Chatelier como una especie no aromática estabilizada por resonancia, de cinco electrones π.