wyniki
struktury wariantu R96A GFPsol przed i po cyklizacji peptydowej. Ponieważ zaproponowano, że R96 aktywuje karbonyl S65 do ataku nukleofilowego (20) lub bezpośrednio deprotonuje amid szkieletowy G67 (22), skonstruowaliśmy wariant R96A i odkryliśmy, że ta punktowa mutacja spowalnia reakcję cyklizacji Z minut do miesięcy., Po oczyszczeniu początkowo bezbarwnego białka r96a, dojrzewanie chromoforu zostało osiągnięte przez inkubację przez 3 miesiące w temperaturze 37°C. nasza struktura krystalograficzna tego dojrzałego białka R96A o rozdzielczości 1,50 Å (Tabela 1) jest bardzo podobna do struktury jego macierzystego gfpsol zoptymalizowanego pod względem rozpuszczalności, z całkowitym odchyleniem Ca RMS wynoszącym 0,20 Å. W GFP R96 tworzy wiązanie wodorowe z tlenem imidazolonu dojrzałego chromoforu. W mutancie R96A trzy cząsteczki wody wypełniają objętość normalnie zajmowaną przez łańcuch boczny R96, ale nie tworzą wiązań wodorowych z tlenem imidazolonu., Może to wyjaśniać przesunięcia maksimum fluorescencji dla wariantu R96A (wzbudzenie 468-nm, emisja 503-nm) w porównaniu z gfpsol (wzbudzenie 489-nm, emisja 508-nm), sugerując, że R96 obniża energię stanu wzbudzonego chromoforu, zgodnie z niepublikowanymi wynikami dla wariantu r96c (4). Co ważne, chromofor wariantu R96A jest w pełni dojrzały (rys. 1a), wykazując, że ten mutant zachowuje wszystkie składniki niezbędne do tworzenia chromoforów.
Modyfikacje Posttranslacyjne ujawnione przez struktury wariantów GFP przed i po cyklizacji szkieletu. Pominięcie| Fo-Fc / mapy gęstości elektronów dla pozostałości chromoforu wyprofilowanych przy 3 σ (Czarne). a) 1,50-Å cyclized r96a structure. b) 2.00-Å precylizacja r96a struktury pośredniej A. (c) 2.00-Å precyclization r96a intermediate B struktury. (d i e) ortogonalne widoki 1.80-Å Gly-Gly-Gly aerobic utlenionej struktury postcyklingu. (F) proponowana struktura molekularna pierścienia cyklizowanego Gly-Gly-Gly. g) 1,80-Å Gly-Gly-Gly beztlenowej struktury precylizacyjnej., Wszystkie są zilustrowane w 3d (44).
- wyświetl inline
- wyświetl popup
wykorzystaliśmy powolne tempo dojrzewania wariantu R96A do wyizolowania półproduktów GFP przed cyklizacją i tym samym określenia dwóch niezależnych struktur krystalograficznych (Tabela 1) GFP przed modyfikacjami posttranslacyjnymi (rys. 1 b I c)., W hipotezie mechanicznej kompresji, steryczne interakcje generowane przez architekturę GFP są proponowane w celu podniesienia energii stanu precyclization powyżej cyclized intermediate i relaks ten napięty konformacji napędza tworzenie chromoforu. W ten sposób zbadaliśmy struktury precylizacyjne r96a o rozdzielczości 2,0 Å pod kątem dowodów oddziaływań sterycznych, które mogłyby zostać złagodzone po utworzeniu chromoforu. Zamiast tego, gęstość elektronów ujawnia korzystne konformacje dla pozostałości chromoforu bez znaczących zderzeń van der Waalsa., Poza pozostałościami chromoforu obie struktury są bardzo podobne (rys. 2A). Atomy Ca nakładają się na siebie z odchyleniem rms wynoszącym 0,28 Å, a zmiany konformacyjne łańcucha bocznego są niewielkie. Co ciekawe, te niezależnie określone struktury wykazują wyraźne konformacje łańcucha bocznego Y66, leżące po obu stronach czwartej nici β (rys. 1 b I c). Każdy stos ma Q94 i zajmuje część wnęki utworzonej przez obcięcie R96. Kryształy użyte do określenia tych różnych struktur pośrednich precylizacji rosły w tych samych warunkach., Dlatego proponujemy, że białko posiada Stany izoenergetyczne dla Y66 z niskimi barierami energetycznymi interkonwersji i że subtelne różnice w pakowaniu kryształów mogą propagować się do rdzenia białka, aby wybrać obserwowane konformacje.
zniekształcenia architektoniczne i porównania strukturalne między Stanami precyklizacji i postcyklizacji. (a) superpozycja struktur R96A, podkreślając dużą zmianę konformacyjną dla Y66, ale poza tym małe różnice Ca między Stanami precylizacyjnymi (a w Kolorze Żółtym, B w Kolorze Niebieskim) i postcyklingowymi (zielonymi)., (b) Centralna helisa dla trzech struktur R96A wyświetlana z powierzchnią dojrzałej struktury r96a, podkreślając wygięcie śrubowe. (c) strukturalna nakładka półproduktów precylizacyjnych r96a a (żółty) i B (niebieski) z dojrzałą strukturą R96A (zielony), wykazującą duże ruchy łańcucha głównego w tworzeniu chromoforu. Modelowany R96 (fioletowy) wskazuje na steryczne interakcje z położeniem łańcucha bocznego Y66 struktury pośredniej precylizacji., (d) superpozycja Gly-Gly-Gly struktur przed (niebieski, beztlenowy) i po (Zielony, tlenowy) cyklizacji peptydów pokazuje interakcje grup funkcjonalnych między atomami tlenu karbonylowego R96, E222 i T62 i pozostałościami chromoforu. (e) schemat zniekształceń w oddziaływaniach wiązania wodorowego z łańcuchem głównym dla WT, Gly-Gly-Gly-Gly i struktur postcyklingowych (po lewej) wyświetlany w porównaniu do kanonicznej helisy α (Po prawej). Stałe linie między atomami głównego łańcucha wskazują na obecność wiązania wodorowego. a-d są zilustrowane za pomocą avs (45).,
porównanie Stanów precylizacyjnych i dojrzałych chromoforów dla struktur R96A identyfikuje zarówno globalne, jak i lokalne cechy, które napędzają cyklizację peptydów. Pomimo dramatycznych ruchów chromoforów, w których fenolowy atom tlenu Y66 przesuwa się o 14 Å, a Atomy szkieletu o 2,6-3,1 Å, pozostałości poza chromoforem nakładają się dobrze dla trzech struktur R96A (rys. 2A). Chromofor jest zakotwiczony zarówno przez sąsiadujące pozostałości hydrofobowe, jak i oddziaływania hydrofobowe na końcach centralnej zniekształconej helisy (rys. 2b)., W sekwencji 48 homologów GFP (Tabela 2, która jest publikowana jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS, www.pnas.org), pozostałość 64, która bezpośrednio poprzedza chromofor, jest zasadniczo pozostałością hydrofobową (41 sekwencji; F, L, V) lub cysteiną (6 sekwencji). Co ciekawe, wszystkie sekwencje zawierające C64 zawierają również C29. Mapowanie tych pozostałości cysteiny na strukturę GFP (dane nie pokazano) umieszcza je w rozsądnej orientacji, aby utworzyć wiązanie dwusiarczkowe i zapewnić alternatywną metodę zakotwiczenia (do oddziaływań hydrofobowych)., Ponadto, pomimo praworęcznych konformacji spiralnych na wykresie Ramachandran, pozostałości tej zniekształconej „helisy” w dojrzałym GFP tworzą tylko trzy główne wiązania wodorowe, między parami pozostałości L60-L64 (α-helisa), V61-S65T (α-helisa) i V68-F71 (310-helisa). Struktury precyklinowe R96A dodają wiązania wodorowe T62-Y66 (α-helisa) i S65T-V68 (310-helisa). Tak więc większość zniekształceń w centralnej helisie nie jest konsekwencją powstawania chromoforów, ale raczej są narzucane przez rusztowanie białkowe., We wszystkich strukturach GFP (1, 17) i jego czerwonych fluorescencyjnych homologów białkowych (35, 36) dramatyczny ≈80° zakręt w helisie (rys. 2b), generowany przez architekturę białka, koncentruje się na chromoforze (rys. 2c). Ciężkie zgięcie naraża atomy tlenu karbonylowego T62 i Y66 na interakcje z R96 (patrz poniżej) i zmusza nukleofil azotu G67 i tlen karbonylowy s65t do bliższego kontaktu (3,0 i 3,2 Å w dwóch strukturach precyklowania) niż suma (3,25 Å) ich promieni van der Waalsa (37), w przygotowaniu do tworzenia wiązań kowalencyjnych podczas cyklizacji peptydowej (rys. 2c)., Co istotne, zniekształcenia te eliminują potencjalne spiralne wiązania wodorowe, które w przeciwnym razie musiałyby zostać zerwane przy koszcie energetycznym podczas cyklizacji. Razem struktury R96A sugerują, że architektura GFP wymusza destabilizujące zniekształcenia, wykluczając stabilną konformację α-spiralną i tworząc stan bliższy stanowi przejścia dla cyklizacji peptydowej., Jest to analogiczne do propozycji stanu entatycznego dla metaloprotein (38), w której rusztowanie białkowe ogranicza centrum metalu w zdestabilizowanej konformacji geometrycznej, aby obniżyć bariery energetyczne reorganizacji i zwiększyć szybkość reakcji.
konstrukcje wariantu S65G Y66G w warunkach tlenowych i beztlenowych. Aby zbadać, czy boczne interakcje pozostałości chromoforu są krytyczne dla cyklizacji szkieletu, skonstruowaliśmy i scharakteryzowaliśmy bezbarwny wariant S65G Y66G (Sekwencja Gly-Gly-Gly dla pozostałości chromoforu)., Wyniki mutacji wykazały, że prawie każda substytucja S65, aromatyczne substytucje Y66 i WT G67 tworzą Dojrzałe chromofory (4). Jeśli jednak mechaniczny model kompresji dla cyklizacji peptydowej (20) lub propozycja, że utlenianie łańcucha bocznego jest wymagane przed cyklizacją (22), były prawidłowe, obcięcie do wariantu Gly-Gly-Gly powinno utrudniać lub wykluczać cyklizację szkieletu. Co ciekawe, gęstość elektronów dla struktury rozdzielczości 1,80 Å tego wariantu (Tabela 1) pokazuje, że szkielet jest cyklizowany., Symulowane wyżarzanie pomiń mapy dla tego cyklicznego wariantu Gly-Gly-Gly (rys. 1 d i e) wykazują, że pierścień imidazolonowy jest przesunięty ≈0,7 Å od swojego położenia w strukturze GFPsol i modyfikowany przez dwa atomy niewodorotlenowe. Pierwszy atom, tlen karbonylowy s65g, nie został utracony jako woda, jak ma to miejsce w przypadku WT GFP. Zamiast tego tlen ten pozostaje przyłączony do pierścienia imidazolonowego i tworzy wiązanie wodorowe z bocznym łańcuchem E222 (rys. 2d)., Drugi ATOM niehydrogenu jest kowalencyjnie związany z Y66g Ca cyklicznego pierścienia i jest najprawdopodobniej atomem tlenu włączonym w wyniku reakcji utleniania (patrz Rys. 4, które są publikowane jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS, dla proponowanego mechanizmu). Potwierdziliśmy, że dodatkowe szczyty w naszych pominiętych mapach były prawdziwe i nie pochodzą z wariantu białka, resekwencjonując plazmid, oczyszczając drugą partię białka, rozwiązując drugą strukturę 2,00-Å i obserwując te same szczyty w nowych pominiętych mapach. Gęstość elektronów (rys., 1d) jest zgodny z pięcioelektronowym, niearomatycznym układem pierścieniowym, który zawiera czworościenny atom węgla karbonylowego s65g (rozbijający cykliczny pierścień), tautomer enolu dla karbonylu y66g i tautomer ketonowy dla nowo wbudowanego atomu tlenu (rys. 1f). Cyklizacja Gly-Gly-Gly, która nie zawiera atomów łańcucha bocznego, argumentuje przeciwko proponowanemu modelowi, w którym utlenianie łańcucha bocznego poprzedza cyklizację (22).
przygotowaliśmy i skrystalizowaliśmy wariant S65G Y66G w warunkach beztlenowych, aby zbadać nieoczekiwane włączenie tlenu w Y66g Ca., Zaskakująco, struktura beztlenowa w rozdzielczości 1,80-Å (Tabela 1) ujawniła niecyklowe pozostałości chromoforu (rys. 1g). Poza chromoforem, struktury Gly-Gly-Gly precyclization i postcyclization są niezwykłe podobne (rys. 2d) i dzielić z WT GFP to samo ograniczone wiązanie wodorowe (6 z 24 możliwych oddziaływań głównego łańcucha) dla centralnej helisy (rys. 2e). Tak więc, nawet dodatkowa elastyczność szkieletowa przyznana przez zastąpienie Gly aminokwasami chromoforowymi nie powoduje powstania dodatkowych wiązań wodorowych łańcucha głównego., Brak wiązań wodorowych w łańcuchu głównym dla pozostałości chromoforu przyczynia się do widocznych niskich barier energetycznych międzykonwersji i dużych lokalnych zmian w cyklizacji obserwowanych w strukturach R96A (powyżej). Zniekształcenia w stanie precyklzacji są utrzymywane w stanie postcyklacji, a nie łagodzone przez powstawanie chromoforów. Argumentuje to przeciwko hipotezie mechanicznej kompresji, ale podkreśla znaczenie architektury GFP w tworzeniu określonej konformacji, która sprzyja cyklizacji peptydowej.,
Gly-Gly-Gly wyniki strukturalne ujawniają konformacyjne i energetyczne cechy krytyczne dla cyklizacji peptydów. Standardowe konformacje łańcucha głównego dla G67 zarówno w Stanach precylizacji (Φ = -90°, Ψ = -16°), jak i postcyk (Φ = -90°, Ψ = -35°) sugerują, że pozorny wymóg dla G67 w tworzeniu chromoforów (4) wynika raczej ze sterycznych niż konformacyjnych ograniczeń. W rzeczywistości modelowany łańcuch boczny Ala dla pozostałości 67 ma znaczące zderzenia van der Waalsa z tlenem karbonylowym T63., Co ważniejsze, niepowodzenie Gly-Gly-Gly sekwencji cyklizacji beztlenowej wskazuje, że cyklizacja w tym mutancie jest sprzężona z utlenianiem. Brak częściowego zajętości cyklicznego produktu w warunkach beztlenowych sugeruje, że struktura precyklingu jest termodynamicznie bardziej stabilna niż cykliczny, ale jeszcze nie utleniony stan., W ten sposób utlenianie służy zwiększeniu sprzężenia elektronicznego wariantu Gly-Gly-Gly i zatrzymaniu niekorzystnego termodynamicznie produktu cyklizacji zgodnie z zasadą Le Chateliera jako stabilizowanego rezonansowo, pięcio-π-elektronowego, niearomatycznego gatunku.