Resultater
Strukturer av R96A GFPsol Variant Før og Etter Peptid Cyclization. Fordi R96 har blitt foreslått å enten aktivere S65 karbonyl for nucleophilic angrep (20) eller direkte deprotonate den G67 ryggraden amide (22), konstruerte vi en R96A-varianten, og oppdaget at dette punktet mutasjon bremser cyclization reaksjon fra minutter til flere måneder., Etter rensing av utgangspunktet fargeløs R96A protein, chromophore kjønnsmodning ble oppnådd ved inkubering i 3 måneder ved 37°C. Vår 1.50-Å-oppløsning krystallografisk strukturen av denne modnet R96A protein (Tabell 1) er svært lik som sin løselighet-optimalisert GFPsol overordnede, med en samlet Ca rms avvik på 0,20 Å. I GFP, R96 danner en hydrogen bånd med imidazolone oksygen av de modne chromophore. I R96A mutant, tre vannmolekyler fylle volum normalt opptatt av R96 side kjede, men ikke klarer å danne hydrogen obligasjoner med imidazolone oksygen., Dette kan forklare endringer i fluorescens maxima for R96A variant (468-nm eksitasjon, 503-nm utslipp) sammenlignet med GFPsol (489-nm eksitasjon, 508-nm-stråling), noe som tyder på at R96 senker opphisset tilstand energi chromophore, i samsvar med upubliserte resultater på R96C variant (4). Viktigst, chromophore av R96A variant er fullt modnet (Fig. 1a), som viser at dette mutant beholder alle komponentene som er avgjørende for chromophore dannelse.
Posttranslational endringer avslørt av strukturer av GFP varianter før og etter ryggraden cyclization. Utelat |Fo – Fc| electron tetthet kart for chromophore rester formet på 3 σ (svart). (a) 1.50-Å cyclized R96A struktur. (b) 2.00-Å precyclization R96A En mellomliggende struktur. (c) 2.00-Å precyclization R96A middels B-strukturen. (d og e) Ortogonale utsikt over 1.80-Å Gly-Gly-Gly aerobic oksidert postcyclization struktur. (f) Foreslått molekylære strukturen av Gly-Gly-Gly cyclized ringen. (g) 1.80-Å Gly-Gly-Gly anaerob precyclization struktur., Alle er illustrert inraster 3d (44).
- Vis inline
- Vis popup
Vi har brukt langsom modning pris på R96A variant for å isolere GFP intermediater før cyclization og dermed avgjøre to uavhengige krystallografisk strukturer (Tabell 1) av GFP før posttranslational endringer (Fig. 1 b) og c)., I mekanisk kompresjon hypotese, steriske vekselsvirkningene generert av GFP arkitektur er foreslått å øke energien på precyclization staten ovenfor som av cyclized middels og avslappende dette anstrengt konformasjon stasjoner chromophore dannelse. Dermed, vi undersøkte 2.0-Å-oppløsning R96A precyclization strukturer for bevis av steriske interaksjoner som kan være avslappet på chromophore dannelse. I stedet electron tetthet avslører gunstig conformations for chromophore rester med ingen signifikante van der Waals kollisjoner., Utenfor chromophore rester, de to strukturene er svært lik (Fig. 2a). Ca atomer overlappe med en rms avvik av 0.28 Å, side-chain-conformational rearrangements er mindre. Interessant, dette uavhengig bestemt strukturer viser tydelig Y66 side-chain-conformations, liggende på hver side av den fjerde β-strand (Fig. 1 b) og c). Hver stabler med Q94 og opptar en del av hulrommet opprettet av truncating R96. Krystaller som brukes til å avgjøre disse forskjellige precyclization mellomliggende strukturer vokste under de samme forholdene., Derfor foreslår vi at proteinet har isoenergetic stater for Y66 med lave interconversion energi barrierer og at små krystall pakking forskjeller kan overføres til protein core for å velge den observerte conformations.
Arkitektoniske skjevheter og strukturelle sammenligninger mellom precyclization og postcyclization stater. (en) Superposisjon av R96A strukturer, med vekt på store conformational endre for Y66 men ellers små Ca forskjeller mellom precyclization (En i gul, B i blått) og postcyclization (grønn) stater., (b) Sentrale helix for tre R96A strukturer vises med overflaten av R96A modne struktur, med vekt på spiralformet bend. (c) Strukturelle overlegg av R96A precyclization intermediater En (gul) og B (blå) med modne R96A (grønn) struktur, som viser store hoved-kjeden bevegelser i forming chromophore. Modellert R96 (lilla) indikerer steriske vekselsvirkningene med Y66 side-chain-posisjon precyclization mellomliggende struktur., (d) Superposisjon av Gly-Gly-Gly strukturer før (blå, anaerob) og etter (grønn, aerobic) peptid cyclization viser funksjonell gruppe interaksjoner mellom R96, E222, og T62 karbonyl oksygen atomer og chromophore rester. (e) Illustrasjon av skjevheter i hoved-kjeden hydrogen-binding-interaksjoner for WT, Gly-Gly-Gly precyclization, og postcyclization strukturer (Venstre) vist i forhold til en kanonisk α-helix (Høyre). Heltrukne linjer mellom hoved-kjeden atomer indikere tilstedeværelse av en hydrogen bond. a–d er illustrert med avs (45).,
Sammenligninger av precyclization og modne chromophore stater for R96A strukturer identifisere både globale og lokale funksjoner som stasjonen peptid cyclization. Til tross for dramatiske bevegelser av chromophore-forming rester, som Y66 fenoliske oksygen atom beveger seg 14 Å og ryggraden atomer shift-2.6–3.1 Å, rester utenfor chromophore overlappes godt for de tre R96A strukturer (Fig. 2a). Den chromophore er forankret både av tilstøtende hydrofobe rester og hydrofobe interaksjoner i endene av sentrale forvrengt helix (Fig. 2b)., I en sekvens justering av 48 GFP homologs (Tabell 2, som er publisert som støtter informasjon på PNAS nettsted, www.pnas.org), rester 64, som umiddelbart forut for den chromophore, er i hovedsak en hydrofobe (41 sekvenser; F, L, V) eller cystein (6 sekvenser) rester. Det er interessant at alle sekvenser som inneholder C64 også inneholde C29. Kartlegging disse cystein rester på GFP struktur (data ikke vist) plasserer dem i en fornuftig retning for å danne en disulfide bond og tilby en alternativ forankring metode (for å hydrofobe interaksjoner)., Videre, til tross for høyre-spiralformet conformations i en i > – hvordan det tomt, rester av denne forvrengt «helix» i modne GFP gjøre bare er tre-kjeden hydrogen obligasjoner, mellom rester par L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), og V68-F71 (310-helix). Den R96A precyclization strukturer legge T62-Y66 (α-helix) og S65T-V68 (310-helix) hydrogen obligasjoner. Dermed, de fleste av skjevheter i sentrale helix er ikke en konsekvens av chromophore dannelse, men heller er pålagt av protein stillaset., I alle strukturer av GFP (1, 17) og dens røde fluorescerende protein homologs (35, 36) en dramatisk ≈80° – bend i helix (Fig. 2b), generert av protein arkitektur, er fokusert på chromophore (Fig. 2c). Den alvorlige bøye avslører T62 og Y66 karbonyl oksygen atomer for samhandling med R96 (se nedenfor), og tvinger G67 nitrogen nucleophile og S65T karbonyl oksygen i nærmere kontakt med hverandre (3.0 og 3.2 Å i to precyclization strukturer) enn summen (3.25➀) av van der Waals radier (37), i forberedelse for covalent bond-formasjonen under peptid cyclization (Fig. 2c)., Betydelig, disse skjevheter eliminere potensielle spiralformet hydrogen obligasjoner som ellers ville ha til å bli brutt på en energisk kostnader ved cyclization. Sammen R96A strukturer som tyder på at GFP arkitektur håndhever destabiliserende skjevheter, er til hinder for en stabil α-helical konformasjon og skape en tilstand nærmere transition state for peptid cyclization., Dette er analogt til entatic staten forslag til metalloproteins (38), som protein stillaset nøder et metall senter i en destabilized geometriske konformasjon til lavere omorganisering energi barrierer og øke reaksjon priser.
Strukturer av S65G Y66G Variant Under Aerobe og Anaerobe Forhold. For å undersøke om side-chain-interaksjoner av chromophore rester er kritisk til ryggraden cyclization, vi konstruert og preget fargeløs S65G Y66G variant (sekvens Gly-Gly-Gly for chromophore rester)., Mutational resultatene har fastslått at nesten alle erstatning for S65, aromatiske innbytter for Y66, og WT G67 form modne chromophores (4). Imidlertid, hvis mekanisk kompresjon modell for peptid cyclization (20) eller forslag som side-chain-oksidasjon er nødvendig før cyclization (22) var riktig, trunkering til Gly-Gly-Gly-varianten skal hindre eller til hinder ryggraden cyclization. Det er bemerkelsesverdig at electron tetthet for en 1.80-Å-oppløsning strukturen av denne varianten (Tabell 1) viser at ryggraden er cyclized., Simulert annealing utelate kart for denne cyclized Gly-Gly-Gly-varianten (Fig. 1 d og e) vis at imidazolone ringen er flyttet ≈0.7 Å fra sin posisjon i GFPsol struktur og endres av to nonhydrogen atomer. Det første atomet, S65G karbonyl oksygen, har ikke gått tapt som vann, som er tilfellet for WT GFP. I stedet, dette oksygen forblir festet til imidazolone ring og danner en hydrogen bånd med siden kjeden av E222 (Fig. 2d)., Den andre nonhydrogen atom er covalently bundet til Y66G Ca av cyclized ringen og er mest sannsynlig et oksygen atom innarbeidet gjennom en oksidasjon reaksjon (se Fig. 4, som er publisert som støtter informasjon på PNAS web-området, for foreslåtte mekanisme). Vi bekreftet at ekstra topper i vår utelate kart var ekte, og ikke hentet fra protein variant av resequencing den plasmider, rensende en annen gruppe av protein, løse en andre 2.00-Å-strukturen, og observere de samme toppene i new uten kart. Elektronet tetthet (Fig., 1d) er konsistent med en fem-π-electron, nonaromatic ring system som inneholder en tetrahedral S65G karbonyl karbonatom (puckering den cyclized ring), en enol tautomer for Y66G karbonyl, og en keto tautomer for den nylig innlemmet oksygen atom (Fig. 1f). Cyclization av Gly-Gly-Gly, som inneholder ingen side-chain-atomer, argumenterer mot den foreslåtte modellen, som side-chain-oksidasjon går forut cyclization (22).
Vi forberedt og krystalliserte S65G Y66G variant under anaerobe forhold til å utforske uventet innblanding av oksygen i Y66G Ca., Overraskende, den anaerobe struktur på 1.80-Å-oppløsning (Tabell 1) avslørte uncyclized chromophore rester (Fig. 1g). Utenfor chromophore, den precyclization og postcyclization Gly-Gly-Gly strukturer er bemerkelsesverdig lik (Fig. 2d) og dele med WT-GFP samme begrenset hydrogenbinding (6 av 24 mulige viktigste-kjeden vekselsvirkningene) for den sentrale helix (Fig. 2e). Dermed kan det også lagt ryggraden fleksibilitet gitt ved substitusjon av Gly for chromophore aminosyrer ikke resulterer i dannelsen av flere hoved-kjeden hydrogen obligasjoner., Mangel på main-kjeden hydrogen obligasjoner for chromophore rester bidrar til den tilsynelatende lave interconversion energi barrierer og store lokale rearrangements for cyclization observert i R96A strukturer (ovenfor). Skjevheter i precyclization staten er opprettholdt i den postcyclization staten, snarere enn avløst av chromophore dannelse. Dette argumenterer mot mekanisk kompresjon hypotese, men understreker viktigheten av GFP arkitektur i å skape en bestemt konformasjon som favoriserer peptid cyclization.,
Gly-Gly-Gly strukturelle resultater avsløre conformational og energisk funksjoner kritiske til peptid cyclization. Standard viktigste-kjeden conformations for G67 i både precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) og postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) usa tyder på at den tilsynelatende kravet for G67 i chromophore dannelse (4) resultater fra steriske snarere enn conformational restriksjoner. Faktisk, en modellert Ala side kjede for rester 67 har betydelig van der Waals kollisjoner med T63 karbonyl oksygen., Enda viktigere, svikt i Gly-Gly-Gly rekkefølge for å cyclize anaerobically indikerer at cyclization i denne mutant er koblet til oksidasjon. Mangelen på en delvis belegg av en cyclized produktet under anaerobe forhold tyder på at precyclization struktur er thermodynamically mer stabil enn en cyclized, men ennå ikke oksidert tilstand., Dermed oksidasjon tjener til å øke den elektroniske konjugasjon av Gly-Gly-Gly-varianten, og felle en thermodynamically ugunstige cyclization produktet i henhold til Le Chatelier ‘ s prinsipp som en resonans-stabilisert, fem-π-electron, nonaromatic arter.