Ergebnisse
Strukturen der R96A GFPsol Variante vor und nach der Peptidzyklisierung. Da R96 vorgeschlagen wurde, entweder das S65 Carbonyl für nukleophile Attacken zu aktivieren (20) oder das G67 Backbone Amid (22) direkt zu deprotonieren, konstruierten wir eine R96A Variante und entdeckten, dass diese Punktmutation die Zyklisationsreaktion von Minuten auf Monate verlangsamt., Nach der Reinigung des anfänglich farblosen R96A-Proteins wurde die Chromophorreifung durch Inkubation für 3 Monate bei 37°C erreicht. Unsere kristallographische Struktur mit 1,50 Å Auflösung dieses gereiften R96A-Proteins (Tabelle 1) ist der seines löslichkeitsoptimierten GFPsol-Elternteils mit einer Gesamt-Ca rms-Abweichung von 0,20 Å sehr ähnlich. In GFP bildet R96 eine Wasserstoffbindung mit dem Imidazolonsauerstoff des reifen Chromophors. In der R96A-Mutante füllen drei Wassermoleküle das normalerweise von der R96-Seitenkette eingenommene Volumen, bilden jedoch keine Wasserstoffbindungen mit dem Imidazolon-Sauerstoff., Dies kann die Verschiebungen der Fluoreszenzmaxima für die R96A-Variante (468-nm-Anregung, 503-nm-Emission) im Vergleich zu GFPsol (489-nm-Erregung, 508-nm-Emission) erklären, was darauf hindeutet, dass R96 senkt die angeregte Zustandsenergie des Chromophors, im Einklang mit unveröffentlichten Ergebnissen auf der R96C-Variante (4). Wichtig ist, dass der Chromophor der R96A-Variante vollständig gereift ist (Abb. 1a), was zeigt, dass diese Mutante alle für die Chromophorbildung wesentlichen Komponenten beibehält.
Posttranslationale Modifikationen durch Strukturen von GFP-Varianten vor und nach der Backbone-Zyklisierung. Weglassen |Fo-Fc / Elektronendichtekarten für die Chromophorreste konturiert bei 3 σ (schwarz). (a) Die 1,50-Å zyklisierte R96A-Struktur. (b) Die 2,00-Å-Präzyklisations-R96A-Zwischen-A-Struktur. (c) Die 2,00-Å-Präzyklisations-R96A-Zwischen-B-Struktur. (d und e) Orthogonale Ansichten der 1,80-Å Gly-Gly-Gly aeroben oxidierten Postcyclisierungsstruktur. (f) Vorgeschlagene molekulare Struktur des Gly-Gly-Gly-cyclisierten Rings. (g) Die 1,80-Å Gly-Gly-Gly anaerobe Präzyklisierungsstruktur., Alle sind illustriert inraster 3d (44).
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Wir haben die langsame Reiferate der R96A-Variante verwendet, um GFP-Zwischenprodukte vor der Zyklisierung zu isolieren und dadurch zwei unabhängige kristallographische Strukturen (Tabelle 1) von GFP vor posttranslationalen Modifikationen zu bestimmen (Abb. 1 b und c)., In der mechanischen Kompressionshypothese werden sterische Wechselwirkungen vorgeschlagen, die durch die GFP-Architektur erzeugt werden, um die Energie des Präzyklisierungszustands über die des zyklisierten Intermediats zu erhöhen und diese angespannte Konformation zu entspannen, die die Chromophorenbildung antreibt. Daher untersuchten wir die Präzyklisationsstrukturen der Auflösung R96A mit 2,0 Å auf Hinweise auf sterische Wechselwirkungen, die bei der Chromophorenbildung gelockert werden könnten. Stattdessen zeigt die Elektronendichte günstige Konformationen für die Chromophorreste ohne signifikante Van-der-Waals-Kollisionen., Außerhalb der Chromophorreste sind die beiden Strukturen sehr ähnlich (Abb. 2a). Die Ca-Atome überlagern sich mit einer Effektivabweichung von 0,28 Å, und seitenketten-konforme Umlagerungen sind gering. Interessanterweise weisen diese unabhängig ermittelten Strukturen unterschiedliche Y66-Seitenkettenkonformationen auf, die auf beiden Seiten des vierten β-Strangs liegen (Abb. 1 b und c). Jeder Stapel mit Q94 und nimmt einen Teil des Hohlraums ein, der durch Abschneiden von R96 erzeugt wird. Die zur Bestimmung dieser unterschiedlichen Präzyklisationszwischenstrukturen verwendeten Kristalle wuchsen unter den gleichen Bedingungen., Daher schlagen wir vor, dass das Protein isoenergetische Zustände für Y66 mit niedrigen Interkonversionsenergiebarrieren besitzt und dass sich subtile Kristallverpackungsunterschiede auf den Proteinkern ausbreiten können, um die beobachteten Konformationen auszuwählen.
Architektonische Verzerrungen und Strukturvergleiche zwischen Präzyklisierungs-und Postzyklisierungszuständen. (a) Überlagerung von R96A-Strukturen, wobei große Konformationsänderungen für Y66 hervorgehoben werden, ansonsten jedoch kleine Ca-Unterschiede zwischen Präzyklisationszuständen (A in Gelb, B in Blau) und Postzyklisationszuständen (grün)., (b) Zentrale Helix für drei R96A-Strukturen, die mit der Oberfläche der R96A-reifen Struktur angezeigt werden und die spiralförmige Biegung betonen. (c) Strukturelle Überlagerung der R96A-Präzyklisationszwischenprodukte A (gelb) und B (blau) mit der reifen R96A-Struktur (grün), die große Hauptkettenbewegungen bei der Bildung des Chromophors zeigt. Modelliert R96 (lila) zeigt sterische Wechselwirkungen mit der Y66-Seitenkettenposition der Präzyklisationszwischenstruktur an., (d) Die Überlagerung der Gly-Gly-Gly-Strukturen vor (blau, anaerob) und nach (grün, aerob) Peptidzyklisierung zeigt funktionelle Gruppeninteraktionen zwischen den Carbonyl-Sauerstoffatomen R96, E222 und T62 und den Chromophorresten. (e) Schematische Darstellung von Verzerrungen in hauptkettigen wasserstoffbindenden Wechselwirkungen für die WT -, Gly-Gly-Gly-Präzyklisations-und Postzyklisationsstrukturen (links) im Vergleich zu einer kanonischen α-Helix (rechts). Feste Linien zwischen hauptkettigen Atomen weisen auf das Vorhandensein einer Wasserstoffbindung hin. a-d sind mit avs (45) illustriert.,
Vergleiche der Präzyklisations-und reifen Chromophorzustände für die R96A-Strukturen identifizieren sowohl globale als auch lokale Merkmale, die die Peptidzyklisierung antreiben. Trotz dramatischer Bewegungen von chromophorbildenden Resten, bei denen sich das Phenolsauerstoffatom Y66 14 Å bewegt und Rückgratatome 2,6–3,1 Å verschieben, überlagern sich Rückstände außerhalb des Chromophors gut für die drei R96A-Strukturen (Abb. 2a). Der Chromophor ist sowohl durch benachbarte hydrophobe Rückstände als auch durch hydrophobe Wechselwirkungen an den Enden der zentralen verzerrten Helix verankert (Abb. 2b)., In einer Sequenzausrichtung von 48 GFP-Homologen (Tabelle 2, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird, www.pnas.org), Rückstand 64, der unmittelbar dem Chromophor vorausgeht, ist im Wesentlichen ein hydrophober (41 Sequenzen; F, L, V) oder Cystein (6 Sequenzen) Rückstand. Interessanterweise enthalten alle Sequenzen, die C64 enthalten, auch C29. Die Abbildung dieser Cysteinreste auf die GFP-Struktur (Daten nicht gezeigt) versetzt sie in eine vernünftige Orientierung, um eine Disulfidbindung zu bilden und eine alternative Verankerungsmethode (für hydrophobe Wechselwirkungen) bereitzustellen., Darüber hinaus bilden die Reste dieser verzerrten „Helix“ in reifen GFP trotz rechtshändiger helikaler Konformationen in einem Ramachandran-Plot nur drei hauptkettige Wasserstoffbrücken zwischen den Rückstandspaaren L60-L64 (α-Helix), V61-S65T (α-Helix) und V68-F71 (α-Helix). Die R96A-Präzyklisationsstrukturen fügen die Wasserstoffbrücken T62-Y66 (α-Helix) und S65T-V68 (α-Helix) hinzu. Somit sind die meisten Verzerrungen in der zentralen Helix keine Folge der Chromophorenbildung, sondern werden durch das Proteingerüst auferlegt., In allen Strukturen von GFP (1, 17) und seinen rot fluoreszierenden Proteinhomologen (35, 36) eine dramatische ≈80° Biegung in der Helix (Abb. 2b), erzeugt durch die Proteinarchitektur, auf den Chromophor fokussiert ist (Abb. 2c). Die starke Biegung setzt die Carbonyl-Sauerstoffatome T62 und Y66 für Wechselwirkungen mit R96 frei (siehe unten) und zwingt den G67-Stickstoffnukleophilen und den S65T-Carbonyl-Sauerstoff in den beiden Präzyklisierungsstrukturen näher in Kontakt (3,0 und 3,2 Å) als die Summe (3,25 Å) ihrer Van der Waals-Radien (37) zur Vorbereitung der kovalenten Bindungsbildung während der Peptidzyklisierung (Abb. 2c)., Bezeichnenderweise eliminieren diese Verzerrungen potenzielle helikale Wasserstoffbrücken, die sonst während der Zyklisierung zu energetischen Kosten abgebrochen werden müssten. Zusammen deuten die R96A-Strukturen darauf hin, dass die GFP-Architektur destabilisierende Verzerrungen erzwingt, eine stabile α-helikale Konformation ausschließt und einen Zustand erzeugt, der näher am Übergangszustand für die Peptidzyklisierung liegt., Dies ist analog zum entatischen Zustandsvorschlag für Metalloproteine (38), bei dem das Proteingerüst ein Metallzentrum in einer destabilisierten geometrischen Konformation einschränkt, um Reorganisationsenergiebarrieren zu senken und Reaktionsraten zu erhöhen.
Strukturen der Variante S65G Y66G Unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Um zu untersuchen, ob Seitenketteninteraktionen der Chromophorreste für die Rückgratzyklisierung kritisch sind, haben wir die farblose Variante S65G Y66G (Sequenz Gly-Gly-Gly für Chromophorreste) konstruiert und charakterisiert., Mutationsergebnisse haben gezeigt, dass fast jede Substitution für S65, aromatische Substitutionen für Y66 und die WT G67 reife Chromophore bilden (4). Wenn jedoch das mechanische Kompressionsmodell für die Peptidzyklisierung (20) oder der Vorschlag, dass eine Seitenkettenoxidation vor der Zyklisierung (22) erforderlich ist, korrekt waren, sollte eine Kürzung auf die Gly-Gly-Gly-Variante die Rückgratzyklisierung behindern oder ausschließen. Bemerkenswert ist, dass die Elektronendichte für eine 1,80-Å Auflösungsstruktur dieser Variante (Tabelle 1) zeigt, dass das Rückgrat zyklisiert ist., Simuliertes Glühen lässt Karten für diese zyklisierte Gly-Gly-Gly-Variante weg (Abb. 1 d und e) zeigen, dass der Imidazolonring ≈0,7 Å von seiner Position in der Gfpsolstruktur verschoben und durch zwei Nichthydrogenatome modifiziert wird. Das erste Atom, der Carbonylsauerstoff S65G, ist nicht wie bei WT GFP als Wasser verloren gegangen. Stattdessen bleibt dieser Sauerstoff am Imidazolonring befestigt und bildet eine Wasserstoffbindung mit der Seitenkette von E222 (Abb. 2d)., Das zweite Nichthydrogenatom ist kovalent an das Y66G Ca des zyklisierten Rings gebunden und ist höchstwahrscheinlich ein Sauerstoffatom, das durch eine Oxidationsreaktion eingebaut wird (siehe Abb. 4, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird, für vorgeschlagenen Mechanismus). Wir bestätigten, dass die zusätzlichen Peaks in unseren Omit-Maps real waren und nicht von der Proteinvariante abgeleitet wurden, indem wir das Plasmid erneut sequenzierten, eine zweite Proteincharge reinigten, eine zweite 2,00-Å-Struktur lösten und die gleichen Peaks in neuen Omit-Maps beobachteten. Die Elektronendichte (Abb., 1d) steht im Einklang mit einem nichtaromatischen Fünf-π-Elektronen-Ringsystem, das ein tetraedrisches Carbonyl-Kohlenstoffatom S65G (Puckern des zyklisierten Rings), ein Enol-Tautomer für das Carbonyl Y66G und ein Keto-Tautomer für das neu eingearbeitete Sauerstoffatom enthält (Abb. 1f). Cyclisierung von Gly-Gly-Gly enthält keine side-chain-Atomen, spricht sich gegen die vorgeschlagene Modell, bei dem side-chain-oxidation vor-cyclisierung (22).
Wir haben die Variante S65G Y66G unter anaeroben Bedingungen vorbereitet und kristallisiert,um den unerwarteten Einbau von Sauerstoff bei Y66G Ca., Überraschenderweise zeigte die anaerobe Struktur bei 1,80-Å-Auflösung (Tabelle 1) unzyklisierte Chromophorreste (Abb. 1g). Außerhalb des Chromophors sind die Präzyklisations-und Postzyklisations-Gly-Gly-Gly-Strukturen bemerkenswert ähnlich (Abb. 2d) und teilen sich mit WT GFP die gleiche begrenzte Wasserstoffbindung (6 von 24 möglichen Hauptketteninteraktionen) für die zentrale Helix (Abb. 2e). Somit führt selbst die zusätzliche Rückgratflexibilität, die durch die Substitution von Gly für die Chromophoraminosäuren entsteht, nicht zur Bildung zusätzlicher hauptkettiger Wasserstoffbrücken., Das Fehlen von hauptkettigen Wasserstoffbrücken für die Chromophorreste trägt zu den offensichtlich niedrigen Interkonversionsenergiebarrieren und großen lokalen Umlagerungen für die Zyklisierung bei, die in den R96A-Strukturen beobachtet werden (oben). Verzerrungen im Präzyklisationszustand werden im Postzyklisationszustand beibehalten, anstatt durch Chromophorbildung gelindert zu werden. Dies argumentiert gegen die mechanische Kompressionshypothese, unterstreicht jedoch die Bedeutung der GFP-Architektur bei der Erstellung einer spezifischen Konformation, die die Peptidzyklisierung begünstigt.,
Die Gly-Gly-Gly-Strukturergebnisse zeigen konforme und energetische Merkmale, die für die Peptidzyklisierung entscheidend sind. Standard-Hauptkettenkonformationen für G67 sowohl in der Präzyklisierung (Φ = -90°, Ψ = -16°) als auch in der Postzyklisierung (Φ = -90°, Ψ = -35°) deuten darauf hin, dass die scheinbare Anforderung für G67 bei der Chromophorbildung (4) eher auf sterische als auf Konformationsbeschränkungen zurückzuführen ist. Tatsächlich weist eine modellierte Ala-Seitenkette für Rückstand 67 erhebliche Van-der-Waals-Kollisionen mit dem T63 Carbonylsauerstoff auf., Noch wichtiger ist, dass das Versagen der Gly-Gly-Gly-Sequenz, anaerob zu zyklisieren, darauf hinweist, dass die Zyklisierung in dieser Mutante an Oxidation gekoppelt ist. Das Fehlen einer Teilbelegung eines zyklisierten Produkts unter anaeroben Bedingungen legt nahe, dass die Präzyklisationsstruktur thermodynamisch stabiler ist als ein zyklisierter, aber noch nicht oxidierter Zustand., Somit dient die Oxidation dazu, die elektronische Konjugation der Gly-Gly-Gly-Variante zu erhöhen und ein thermodynamisch ungünstiges Zyklisierungsprodukt nach Le Chateliers Prinzip als resonanzstabilisierte, Fünf-π-Elektronen-nichtaromatische Spezies einzufangen.