eredmények
R96a Gfpsol variáns struktúrái mutattak ki a peptid-Ciklizáció előtt és után. Mivel az R96-ot javasolták az S65 karbonil aktiválására nukleofil támadás esetén (20), vagy közvetlenül a G67 gerinchálózat amidjának deprotonálására (22), létrehoztunk egy r96a változatot, és felfedeztük, hogy ez a pontmutáció percről hónapra lassítja a ciklizációs reakciót., A tisztítási folyamat után az eredetileg színtelen R96A fehérje, chromophore érés volt elérni inkubációs 3 hónapig 37°C. A 1.50-Å felbontás kristályos szerkezetét a érlelt R96A fehérje (1. Táblázat) rendkívül hasonló az oldhatóság-optimalizált GFPsol szülő, egy átfogó Ca rms eltérés 0,20 Å. A GFP-ben az R96 hidrogénkötést képez az érett kromofor imidazolon oxigénjével. Az r96a mutánsban három vízmolekula tölti ki az R96 oldallánc által általában elfoglalt térfogatot, de nem képez hidrogénkötéseket az imidazolon oxigénnel., Ez magyarázhatja a fluoreszcencia maxima eltolódását az R96A változatnál (468 nm-es gerjesztés, 503 nm-es emisszió) a gfpsol-hoz képest (489 nm gerjesztés, 508 nm-es emisszió), ami arra utal, hogy az R96 csökkenti a kromofor gerjesztett állami energiáját, összhangban az R96C változat nem publikált eredményeivel (4). Fontos, hogy az r96a változat kromofórja teljesen érett (ábra. 1A), bizonyítva, hogy ez a mutáns megtartja a kromofor képződéséhez szükséges összes összetevőt.
poszttranszlációs módosítások, amelyeket a GFP variánsok struktúrái tártak fel a gerinc ciklizációja előtt és után. A 3 σ (fekete) színárnyalatú kromofórmaradványok Omit |Fo – Fc| elektronsűrűségi térképei. a) az 1.50-Å ciklizált R96A szerkezet. b) A 2.00-Å előfeldolgozási R96A köztes a struktúra. c) A 2.00-Å előfeldolgozási R96A köztes B struktúra. (d és e) ortogonális nézetek az 1.80-Å Gly-Gly aerob oxidált postcyclization szerkezetről. f) A Gly-Gly-Gly ciklizált gyűrű javasolt molekuláris szerkezete. g) az 1.80-Å Gly-Gly-Gly anaerob prekiklizációs szerkezet., Minden illusztrált inraster 3d (44).
- Inline
- nézet felugró
használtuk a lassú érés mértéke a R96A változat elkülöníteni GFP intermedierek előtt cyclization, s ezáltal meghatározza a két független kristályos szerkezetek (1. Táblázat) a GFP előtt poszt-transzlációs módosítások (Fig. 1 b és c)., A gépi kompressziós hipotézis, steric kölcsönhatások által generált GFP építészet javasolt emelni az energia, a precyclization állam felett, hogy a cyclized köztes, pihentető ez a feszült felépítésű vezet chromophore kialakulását. Így megvizsgáltuk a 2.0-Å felbontású r96a prekiklizációs struktúrákat a szterin kölcsönhatások bizonyítékaként, amelyek a kromofor kialakulásakor enyhülhetnek. Ehelyett az elektronsűrűség kedvező konformációkat tár fel a kromofórmaradványok számára, jelentős van der Waals ütközések nélkül., A kromofórmaradványokon kívül a két szerkezet nagyon hasonló (ábra. 2a). A Ca atomok 0,28 Å RMS eltéréssel helyezkednek el, az oldallánc konformációs átrendeződések pedig kisebbek. Érdekes, hogy ezek a önállóan meghatározott struktúrák különálló Y66 oldallánc-konformációkat mutatnak, amelyek a negyedik β-szál mindkét oldalán fekszenek (ábra. 1 b és c). Mindegyik Q94-es Stack az r96 csonkolásával létrehozott üreg egy részét foglalja el. A különböző prekiklizációs köztes struktúrák meghatározására használt kristályok azonos körülmények között nőttek., Ezért azt javasoljuk, hogy a fehérje izoenergetikus állapotokkal rendelkezik az Y66 esetében, alacsony interkonverziós energiakorlátokkal, és hogy a finom kristálycsomagolási különbségek terjedhetnek a fehérjemagba a megfigyelt konformációk kiválasztásához.
építészeti torzulások és szerkezeti összehasonlítások az előfeldolgozási és utófeldolgozási állapotok között. a) az R96a-struktúrák szuperpozíciója, hangsúlyozva az Y66 nagy konformációs változását, de egyébként kis Ca-különbségek az előciklizáció (a sárga, B kék) és a posztciklizáció (zöld) Államok között., b) Központi spirál három r96a szerkezethez, amelyek az r96a Érett szerkezet felületével jelennek meg, hangsúlyozva a spirális hajlítást. c) az r96a prekiklizáció szerkezeti átfedése az érett r96a (zöld) szerkezetű a (sárga) és B (kék) intermediereket tartalmaz, amelyek nagy főláncú mozgásokat mutatnak a kromofor kialakításában. Modellezett r96 (lila) azt jelzi, steric kölcsönhatások az Y66 oldallánc helyzetét a precyclization közbenső szerkezet., d) A Gly – Gly struktúrák szuperpozíciója az r96, E222 és a T62 karbonil-oxigén atomok és a kromofor-maradékok közötti funkcionális csoport kölcsönhatásokat mutatja (kék, anaerob) és (zöld, aerob) peptid-ciklizáció előtt. (e) Sematikus torzulások fő-lánc hidrogén-kötés kölcsönhatások a WT, Glicin-Glicin-Glicin precyclization, valamint postcyclization struktúrák (Balra) jelenik meg képest egy kanonikus α-helix (Jobbra). A főláncatomok közötti szilárd vonalak hidrogénkötés jelenlétét jelzik. a-d illusztrált avs (45).,
az r96a struktúrák prekiklizációs és érett kromofórállapotainak összehasonlításai mind a peptidciklizációt hajtó globális, mind a helyi jellemzőket azonosítják. A kromoforképző maradványok drámai mozdulatai ellenére, amelyekben az Y66 fenolos oxigénatom 14 Å-t mozgat, a gerincatomok pedig 2,6–3,1 Å-t, a kromofóron kívüli maradványok jól helyezkednek el a három R96A szerkezetnél (ábra. 2a). A kromofórt mind a szomszédos hidrofób maradványok, mind a hidrofób kölcsönhatások rögzítik a központi torzított hélix végein (ábra. 2b)., 48 GFP homológok sorrendjében (2. táblázat, amely a PNAS webhelyén támogató információként jelenik meg, www.pnas.org), a 64-es maradék, amely közvetlenül megelőzi a kromofórt, lényegében hidrofób (41 szekvencia; F, L, V) vagy cisztein (6 szekvencia) maradék. Érdekes, hogy a C64-et tartalmazó összes szekvencia C29-et is tartalmaz. Ezeknek a ciszteinmaradványoknak a feltérképezése a GFP szerkezetére (az adatok nem láthatók) ésszerű orientációba helyezi őket, hogy diszulfidkötést képezzenek, és alternatív rögzítési módszert biztosítsanak (hidrofób kölcsönhatásokhoz)., Ezen túlmenően a Ramachandran-parcellában a jobbkezes spirális konformációk ellenére ennek a torzított “helixnek” a maradványai Érett GFP-ben csak három főláncú hidrogénkötést hoznak létre, az L60-L64 (α-helix), A V61-S65T (α-helix) és a v68-F71 (310-helix) maradékpár között. Az R96A prekiklizációs szerkezetek a T62-Y66 (α-helix) és az S65T-V68 (310-helix) hidrogénkötéseket adják hozzá. Így a központi hélix torzulásainak nagy része nem a kromofor képződésének következménye,hanem inkább a fehérje állványa., A GFP (1, 17) és vörös fluoreszcens fehérje homológjainak (35, 36) minden szerkezetében drámai ≈80° – os kanyar van a hélixben (ábra. 2b), által generált fehérje architektúra, középpontjában a kromofor (ábra. 2c). A súlyos kanyarban kiteszi a T62, valamint Y66 karbonil oxigén atomok kölcsönhatások R96 (lásd alább), valamint erők a G67 nitrogén nucleophile, valamint S65T karbonil oxigén a szorosabb kapcsolat (3.0 3.2 Å a két precyclization struktúrák), mint a sum (3.25 Å) a van der Waals sugarak (37), a felkészülés kovalens kötés kialakulása során peptid cyclization (Fig. 2c)., Ezek a torzulások jelentősen kiküszöbölik a lehetséges spirális hidrogénkötéseket, amelyeket egyébként a ciklizáció során energetikai költséggel kell megtörni. Az R96A struktúrák együttesen azt sugallják, hogy a GFP architektúra destabilizáló torzulásokat hajt végre, kizárva a stabil α-spirális konformációt, és közelebb hozva az átmeneti állapothoz a peptid ciklizációhoz., Ez hasonló a metalloproteinekre vonatkozó entatikus állami javaslathoz (38), amelyben a fehérje állvány egy fémközpontot destabilizált geometriai konformációban kényszerít az alacsonyabb reorganizációs energiakorlátokra és növeli a reakciósebességet.
az S65g Y66G változat szerkezete aerob és anaerob körülmények között. Annak megvizsgálására, hogy a kromofórmaradványok oldallánc-kölcsönhatásai kritikusak-e a gerinchálózat ciklizációjához, elkészítettük és jellemeztük a színtelen S65G Y66G változatot (a kromofórmaradványok szekvenciája Gly-Gly)., A mutációs eredmények azt mutatták, hogy az S65 szinte bármilyen helyettesítése, az Y66 aromás helyettesítése, a WT G67 pedig érett kromofórokat képez (4). Ha azonban a peptid-ciklizációra (20) vonatkozó mechanikus kompressziós modell vagy az a javaslat, hogy az oldallánc-oxidációra a ciklizáció előtt szükség van (22), helyes, a Gly-Gly-változatra történő csonkolásnak akadályoznia kell vagy meg kell akadályoznia a gerinc ciklizációját. Figyelemre méltó, hogy ennek a változatnak az 1,80-Å felbontású szerkezetének elektronsűrűsége (1.táblázat) azt mutatja, hogy a gerinc ciklizált., Szimulált lágyítás kihagyja térképek erre a ciklizált Gly-Gly-Gly változat (ábra. 1 d és e) azt mutatják,hogy az imidazolon gyűrű ≈0,7 Å-t tolódik el a gfpsol szerkezetben lévő helyzetéből, és két nem-hidrogénatom módosítja. Az első atom, az S65G karbonil oxigén, nem veszett el vízként, mint a WT GFP esetében. Ehelyett ez az oxigén az imidazolon gyűrűhöz csatlakozik, és hidrogénkötést képez az e222 oldalláncával (ábra). 2d)., A második nem-hidrogénatom kovalensen kötődik a ciklizált gyűrű Y66G Ca-jához, és valószínűleg egy oxidációs reakció révén beépített oxigénatom (Lásd az ábrát. 4, amelyet a PNAS honlapján támogató információként tesznek közzé a javasolt mechanizmusra vonatkozóan). Megerősítettük, hogy a plusz csúcsok a kihagyja térképek valódi volt, nem származik a fehérje variáns által resequencing a plazmid, megtisztítja a második adag fehérje, megoldani egy második 2.00-Å szerkezet, betartva az azonos csúcsok új kihagyja térképek. Az elektron sűrűsége (ábra., 1d) összhangban van egy öt-π-elektron, nemaromatikus gyűrűrendszerrel, amely tetraéderes s65g karbonil-szénatomot tartalmaz (a ciklizált gyűrűt puckering), egy enol tautomer az Y66G karbonilhoz, valamint egy keto tautomer az újonnan beépített oxigénatomhoz (ábra. 1f). A Gly-Gly-Gly ciklizációja, amely nem tartalmaz oldallánc atomokat, a javasolt modell ellen érvel, amelyben az oldallánc-oxidáció megelőzi a ciklizációt (22).
anaerob körülmények között elkészítettük és kikristályosítottuk az s65g Y66G változatot, hogy felfedezzük az oxigén váratlan beépülését az Y66G Ca-ba., Meglepő módon az anaerob szerkezet 1,80-Å felbontással (1.táblázat) nem kezelt kromofórmaradványokat tárt fel (1. ábra). 1g). A kromofóron kívül a prekiklizáció és a posztciklizáció is figyelemre méltó (1.ábra). 2D) és ossza meg a WT GFP-vel Ugyanazt a korlátozott hidrogénkötést (24 lehetséges főlánc-kölcsönhatásból 6) a központi hélixhez (ábra. E.2. Így még az a gerinchálózat-rugalmasság is, amelyet a Gly helyettesítése biztosít a kromofor aminosavakra, nem eredményez további főláncú hidrogénkötések kialakulását., A kromofórmaradványok főláncú hidrogénkötéseinek hiánya hozzájárul az r96a struktúrákban (fent) megfigyelt látszólagos alacsony interkonverziós energiakorlátokhoz és a ciklizációhoz szükséges nagy helyi átrendeződésekhez. Az előfeldolgozási állapot torzulásait a posztciklizációs állapotban tartják fenn, nem pedig a kromofor képződésével. Ez a mechanikai tömörítési hipotézis ellen érvel, de hangsúlyozza a GFP architektúra fontosságát egy olyan specifikus konformáció létrehozásában, amely kedvez a peptid-ciklizációnak.,
a Gly-Gly szerkezeti eredmények a peptid-ciklizációra kritikus konformációs és energetikai jellemzőket tárnak fel. A G67 standard főlánc-konformációi mind a prekiklizációban (Φ = -90°, Ψ = -16°), mind a Posztciklizációban (Φ = -90°, Ψ = -35°) azt sugallják, hogy a G67-nek a kromoforképződésben (4) nyilvánvaló követelménye a szterikus, nem pedig a konformációs korlátozásokból származik. Valójában egy modellezett Ala oldalsó lánc a maradék 67 jelentős van der Waals ütközések a T63 karbonil oxigén., Ennél is fontosabb, hogy a Gly-Gly-szekvencia anaerob ciklizálására való kudarca azt jelzi, hogy ebben a mutánsban a ciklizáció oxidációhoz kapcsolódik. Anaerob körülmények között a ciklizált termék részleges kihasználtságának hiánya azt sugallja, hogy az előfeldolgozási szerkezet termodinamikailag stabilabb, mint egy ciklizált, de még nem oxidált állapot., Így az oxidáció a célt szolgálja, hogy növelje az elektronikus ragozás a Glicin-Glicin-Glicin változat pedig csapda egy termodinamikai vizsgálatára kedvezőtlen cyclization termék szerint a Le Chatelier-elv, mint egy rezonancia-stabilizált, öt-π-elektron, nonaromatic faj.