Resultater
Strukturer R96A GFPsol Variant Før og Efter Peptid Ringslutning. Fordi R96 er blevet foreslået til enten at aktivere S65 carbonyl for nucleophilic angreb (20) eller direkte deprotonate den G67 rygraden amid (22), har vi konstrueret en R96A variant og opdagede, at dette punkt mutation bremser ringslutning reaktion fra minutter til måneder., Efter oprensning af det i første omgang farveløs R96A protein, chromophore modning blev opnået ved inkubation i 3 måneder ved 37°C. Vores 1.50-Å beslutning krystallografiske struktur af denne modnet R96A protein (Tabel 1), er meget lig dets opløselighed-optimeret GFPsol forælder, der har et samlet Ca rms afvigelse på 0,20 Å. I GFP danner R96 en hydrogenbinding med imida .olono oxygenygenet af den modne chromophore. I r96a-mutanten fylder tre vandmolekyler det volumen, der normalt optages af R96-sidekæden, men undlader at danne hydrogenbindinger med imida .olono .ygenet., Dette kan forklare ændringer i fluorescens maksima for R96A variant (468-nm excitation, 503-nm emission) sammenlignet med GFPsol (489-nm excitation, 508-nm-emission), hvilket tyder på, at R96 sænker den exciterede tilstand energi chromophore, i overensstemmelse med ikke-offentliggjorte resultater på R96C variant (4). Det er vigtigt, at kromoforen i r96a-varianten er fuldt modnet (Fig. 1a), hvilket viser, at denne mutant bevarer alle komponenter, der er essentielle for dannelse af chromophore.
Posttranslational modifikationer afsløret af strukturer af GFP varianter før og efter backbone cycli .ation. Udelad / Fo – FC / elektrondensitetskort for kromoforresterne kontureret ved 3 ((sort). (A) den 1,50-Å cykliserede r96a-struktur. (B) 2.00-Å precycli .ation R96A mellemliggende a struktur. (C) 2.00-Å precycli .ation R96A mellemliggende B Struktur. (D og e) ortogonale afbildninger af den 1,80-Å Gly-Gly-Gly aerobe o .iderede postcykliseringsstruktur. f) foreslået molekylstruktur af den Gly-Gly-Gly cycliserede ring. g) Den 1,80-Å Gly-Gly-Gly anaerobe præcycliseringsstruktur., Alle er illustreret inraster 3d (44).
- Vis inline
- Vis popup
Vi har brugt den langsomme modning sats af R96A variant til at isolere GFP mellemprodukter, før ringslutning, og dermed afgøre to uafhængige krystallografiske strukturer (Tabel 1) af GFP, før posttranslational modifications (Fig. 1 b og c)., I den mekaniske kompressionshypotese foreslås steriske interaktioner genereret af GFP-arkitekturen at hæve energien i præcycliseringstilstanden over den cykliske mellemliggende og afslappende denne anstrengte konformation driver kromofordannelse. Således undersøgte vi 2.0-Å opløsning R96A precycli .ation strukturer for tegn på steriske interaktioner, der kunne lempes ved chromophore dannelse. I stedet afslører elektrondensiteten gunstige konformationer for kromoforresterne uden signifikante van der .aals-kollisioner., Uden for kromoforresterne er de to strukturer meget ens (fig. 2a). Ca-atomerne overlejres med en RMS-afvigelse på 0,28 Å, og sidekædekonformationelle omlejringer er mindre. Interessant nok udviser disse uafhængigt bestemte strukturer forskellige Y66 sidekædekonformationer, der ligger på hver side af den fjerde β-streng (fig. 1 b og c). Hver stakke med9494 og optager en del af hulrummet skabt af trunkerende R96. Krystallerne, der blev brugt til at bestemme disse forskellige precycli .ation mellemliggende strukturer voksede under de samme betingelser., Således foreslår vi, at proteinet besidder isoenergetiske tilstande for Y66 med lave interkonversionsenergibarrierer, og at subtile krystalpakningsforskelle kan forplantes til proteinkernen for at vælge de observerede konformationer.
arkitektoniske forvridninger og strukturelle sammenligninger mellem precycli .ation og postcycli .ation stater. (a) Superposition af R96A strukturer, der understreger store konformationelle ændre for Y66 men ellers små Ca forskelle mellem precyclization (En i gul, B i blå) og postcyclization (grøn) stater., (B) Central Heli.for tre r96a strukturer vises med overfladen af r96a modne struktur, understreger spiralformet bøjning. (c) Strukturelle overlejring af R96A precyclization mellemprodukter En (gul) og B (blå) med den gamle R96A (grøn) struktur, der viser store main-kæde bevægelser i dannelsen af den chromophore. Modelleret R96 (lilla) indikerer steriske interaktioner med Y66 sidekædepositionen af precycli intermediateation mellemliggende struktur., (d) Superposition af Gly-Gly-Gly strukturer før (blå, anaerob) og efter (grøn, aerob) peptid ringslutning viser funktionelle gruppe interaktioner mellem R96, E222, og T62 carbonyl ilt-atomer, og chromophore rester. (e) Skematisk af forvridninger i main-kæde hydrogen-binding interaktioner for WT, Gly-Gly-Gly precyclization, og postcyclization strukturer (til Venstre) vises i forhold til en kanonisk α-helix (til Højre). Faste linjer mellem hovedkædetatomer indikerer tilstedeværelse af en hydrogenbinding. a-d er illustreret med avs (45).,
Sammenligninger af precyclization og gamle chromophore stater for R96A strukturer identificere både globale og lokale funktioner, der drev peptid ringslutning. Trods den kraftige bevægelser af chromophore-danne restprodukter, som Y66 phenol ilt atom bevæger sig 14 Å og rygraden atomer skift 2.6–3.1 Å, rester uden for chromophore oven godt for de tre R96A strukturer (Fig. 2a). Kromoforen forankres både ved tilstødende hydrofobe rester og hydrofobe interaktioner i enderne af den centrale forvrængede Heli. (fig. 2b)., I en sekvens alignment af 48 GFP homologer (Tabel 2, som er udgivet som støtte til oplysninger om PNAS web-site, www.pnas.org), rest 64, hvor der står umiddelbart foran den chromophore, er hovedsageligt en hydrofobe (41 sekvenser; F, L, V) eller cystein (6 sekvenser) restkoncentrationer. Interessant nok indeholder alle de sekvenser, der indeholder C64, også C29. Kortlægning af disse cysteinrester på GFP-strukturen (data ikke vist) placerer dem i en rimelig orientering for at danne en disulfidbinding og tilvejebringe en alternativ forankringsmetode (til hydrofobe interaktioner)., Desuden, på trods af højre-hånds cylindriske former i en Ramachandran plot, rester af denne fordrejet “helix” i gamle GFP gøre kun er tre-kæde hydrogenbindinger mellem rest par L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), og V68-F71 (310-helix). Den R96A precyclization strukturer tilføje T62-Y66 (α-helix) og S65T-V68 (310-helix) hydrogen-bindinger. Således er de fleste forvrængninger i den centrale Heli.ikke en konsekvens af kromofordannelse, men pålægges snarere af protein stilladset., I alle strukturer af GFP (1, 17) og dets røde fluorescerende proteinhomologer (35, 36) en dramatisk bend 80 bend bøjning i Heli .en (fig. 2b), der genereres af proteinarkitekturen, er fokuseret på chromophoren (fig. 2c). Den alvorlige bøje udsætter T62 og Y66 carbonyl ilt atomer for interaktioner med R96 (se nedenfor), og tvinger G67 kvælstof nucleophile og S65T carbonyl ilt i tættere kontakt (3,0 og 3,2 Å i de to precyclization strukturer), end den sum (3.25 Å) af deres van der Waals-radier (37), som forberedelse til kovalent binding dannelse under peptid ringslutning (Fig. 2c)., Væsentligt eliminerer disse forvrængninger potentielle spiralformede hydrogenbindinger, som ellers skulle brydes til en energisk pris under cyclisering. Sammen antyder r96a-strukturerne, at GFP-arkitekturen håndhæver destabiliserende forvrængninger, hvilket forhindrer en stabil a-spiralformet konformation og skaber en tilstand tættere på overgangstilstanden for peptidcyklisering., Dette er analogt med entatic state-forslaget til metalloproteiner (38), hvor protein-stilladset begrænser et metalcenter i en destabiliseret geometrisk konformation for at sænke omorganiseringsenergibarrierer og øge reaktionshastighederne.
strukturer af S65g Y66g-varianten under aerobe og anaerobe forhold. For at undersøge om side-chain interaktioner af chromophore rester er afgørende for at rygraden ringslutning, vi fremstillet og karakteriseret farveløs S65G Y66G variant (sekvens Gly-Gly-Gly for chromophore rester)., Mutationsresultater har vist, at næsten enhver substitution for S65, aromatiske substitutioner for Y66 og formt G67 danner modne chromophorer (4). Men hvis mekanisk kompression model for peptid ringslutning (20) eller de forslag, som side-chain oxidation er påkrævet, før ringslutning (22) var korrekte, trunkering til Gly-Gly-Gly-variant, skal hindre eller til hinder rygraden ringslutning. Bemærkelsesværdigt afslører elektrondensiteten for en 1,80-Å opløsningsstruktur af denne variant (tabel 1), at rygraden cykliseres., Simuleret udglødning udelader kort for denne cykliske Gly-Gly-Gly variant (fig. 1 D og e) viser, at imida .olonringen forskydes ≈0.7 Å fra sin position i gfpsol-strukturen og ændres af to nonhydrogenatomer. Det første atom, s65g carbonyl o .ygen, er ikke gået tabt som vand, som det er tilfældet for .t GFP. I stedet forbliver dette ilt fastgjort til imida .olonringen og danner en hydrogenbinding med sidekæden af E222 (Fig. 2d)., Det andet nonhydrogenatom er kovalent bundet til Y66G Ca i den cykliske ring og er sandsynligvis et O .ygenatom inkorporeret gennem en O .idationsreaktion (se Fig. 4, der offentliggøres som understøttende information på PNAS-webebstedet for foreslået mekanisme). Vi har bekræftet, at ekstra toppe i vores udelade kort var virkelige og ikke stammer fra protein variant af resequencing plasmidet, rensende en anden batch af protein, løse en anden 2.00-Å struktur, og observere de samme toppe i nye udelade kort. Elektrontætheden (fig., 1d), er i overensstemmelse med en fem-π-elektroner, aromatiske ring system, der indeholder en tetrahedrale S65G carbonyl-carbon-atom (puckering cyclized ring), en enol tautomer for Y66G carbonyl, og en keto tautomer for nyligt inkorporeret ilt-atom (Fig. 1f). Ringslutning af Gly-Gly-Gly, som ikke indeholder nogen side-chain atomer, som argumenterer imod den foreslåede model, som side-chain oxidation forud ringslutning (22).
Vi forberedte og krystalliserede s65g Y66G-varianten under anaerobe forhold for at undersøge den uventede inkorporering af ilt ved Y66G Ca., Overraskende afslørede den anaerobe struktur ved 1, 80-Å-opløsning (tabel 1) ucykliske kromoforrester (fig. 1 g). Uden for kromoforen er precycli structuresation og postcycli structuresation Gly-Gly-Gly strukturer bemærkelsesværdige lignende (fig. 2d) og deler med WT GFP den samme begrænsede hydrogenbinding (6 ud af 24 mulige hovedkædeinteraktioner) for den centrale Heli. (fig. 2e). Således resulterer selv den tilsatte rygradsfleksibilitet, der opnås ved substitution af Gly for chromophore-aminosyrerne, ikke i dannelsen af yderligere hovedkædede hydrogenbindinger., Manglen på hovedkædede hydrogenbindinger til kromoforresterne bidrager til de tilsyneladende lave interkonverteringsenergibarrierer og store lokale omlejringer til cyclisering observeret i r96a-strukturerne (ovenfor). Forvrængninger i precycli stateation tilstand opretholdes i postcycli stateation tilstand, snarere end lettet ved chromophore dannelse. Dette argumenterer imod den mekaniske kompressionshypotese, men understreger vigtigheden af GFP-arkitekturen i at skabe en specifik konformation, der favoriserer peptidcyclisering.,de Gly-Gly-Gly strukturelle resultater afslører konformationelle og energiske funktioner, der er kritiske for peptidcyclisering. Standard main-kæde former for G67 i både precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) og postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) stater, der tyder på, at den tilsyneladende krav til G67 i chromophore dannelse (4) resultater fra sterisk snarere end konformationelle begrænsninger. Faktisk har en modelleret Ala-sidekæde til Rest 67 betydelige van der collaals-kollisioner med T63 carbonylo .ygen., Mere vigtigere, svigt af Gly-Gly-Gly-sekvens til cyclize anaerobt angiver, at ringslutning i denne mutant er koblet til oxidation. Manglen på delvis belægning af et cykliseret produkt under anaerobe forhold antyder, at præcycliseringsstrukturen er termodynamisk mere stabil end en cykliseret, men endnu ikke o .ideret tilstand., Således oxidation tjener til at øge den elektroniske konjugation af Gly-Gly-Gly-variant og fælde en termodynamisk ugunstige ringslutning produktet i henhold til Le Chatelier ‘ s princip som en resonans-stabiliseret, fem-π-elektroner, aromatiske arter.