resultat
strukturer av R96a GFPsol varianten före och efter Peptidcyklisering. Eftersom R96 har föreslagits att antingen aktivera S65 carbonyl för nucleophilic attack (20) eller direkt deprotonate den G67 ryggraden amid (22), konstruerade vi en R96A variant och upptäckte att denna punkt mutation bromsar cyclization reaktion från några minuter till flera månader., Efter rening av det initialt färglösa r96a-proteinet uppnåddes kromoformognad genom inkubation i 3 månader vid 37 ° C. vår 1,50-Å-upplösningskristallografiska struktur av detta mogna r96a-protein (Tabell 1) är mycket lik den hos dess löslighetsoptimerade gfpsol-förälder, med en total ca RMS-avvikelse på 0,20 Å. I GFP bildar R96 en vätebindning med imidazolonsyret hos den mogna kromoforen. I r96a-mutanten fyller tre vattenmolekyler den volym som normalt upptas av R96-sidokedjan men misslyckas med att bilda vätebindningar med imidazolonsyret., Detta kan förklara förändringarna i fluorescens maxima för r96a-varianten (468-nm excitation, 503-nm emission) jämfört med gfpsol (489-nm excitation, 508-nm emission), vilket tyder på att R96 sänker kromoforens exciterade tillståndsenergi, i överensstämmelse med opublicerade resultat på r96c-varianten (4). Det viktigaste är att kromoforen för r96a-varianten är helt mognad (Fig. 1a), vilket visar att denna mutant behåller alla komponenter som är väsentliga för kromoforbildning.
posttranslationella modifieringar avslöjade av strukturer av GFP-varianter före och efter backbone cyclization. Utelämna| fo-Fc / electron density kartor för kromoforrester konturerade vid 3 σ (svart). A) Den 1,50-Å cykliserade r96a-strukturen. B) den 2,00-Å precyklisering R96A mellanliggande a struktur. C) den 2,00-Å precyklisering r96a mellanliggande B Struktur. (d och e) ortogonala vyer av 1.80-Å Gly-Gly aerob oxiderad postcyclization struktur. f) föreslagen molekylär struktur av den Gly-Gly-Gly cykliserade ringen. g) den 1.80-Å Gly-Gly-Gly anaeroba precykliseringsstrukturen., Alla illustreras inraster 3d (44).
- Visa inline
- visa popup
vi använde r96a-variantens långsamma mognadsgrad för att isolera GFP-intermediärer före cyklisering och därigenom bestämma två oberoende kristallografiska strukturer (Tabell 1) av GFP före posttranslationella modifieringar (Fig. 1 b och c)., I den mekaniska kompressionshypotesen föreslås steriska interaktioner som genereras av GFP-arkitekturen för att höja energin i precykliseringstillståndet ovanför den cykliserade mellanliggande och avkopplande denna ansträngda konformation Driver kromoforbildning. Således undersökte vi 2.0-Å resolution R96A precykliseringsstrukturer för bevis på steriska interaktioner som kan slappna av vid kromoforbildning. I stället avslöjar elektrondensiteten gynnsamma konformationer för kromoforrester med inga signifikanta van der Waals kollisioner., Utanför kromoforrester är de två strukturerna mycket lika (Fig. 2a). Ca-atomerna överlagras med en RMS-avvikelse på 0,28 Å, och sidokedjans konformationella omarrangemang är mindre. Intressant är att dessa oberoende bestämda strukturer uppvisar distinkta Y66 sidokedjekonformationer, som ligger på vardera sidan av den fjärde β-strängen (Fig. 1 b och c). Varje staplar med Q94 och upptar en del av kaviteten som skapas genom trunkering R96. Kristallerna som används för att bestämma dessa olika precyklisering mellanliggande strukturer växte under samma förhållanden., Således föreslår vi att proteinet har isoenergetiska tillstånd för Y66 med låga interkonverteringsenergibarriärer och att subtila kristallförpackningsskillnader kan sprida sig till proteinkärnan för att välja de observerade konformationerna.
arkitektoniska snedvridningar och strukturella jämförelser mellan precyklisering och postcykliseringstillstånd. (a) Överlagring av R96A strukturer, med betoning på stora konformationsanalys förändring för Y66 men annars små Ca skillnader mellan precyclization (En i gult, B i blått) och postcyclization (grön) stater., (B)Central helix för tre r96a strukturer visas med ytan av r96a mogen struktur, betonar Spiral böj. C) strukturell överlagring av r96a precykliseringsintermediärer a (gul) och B (blå) med den mogna r96a (grön) strukturen, som visar stora huvudkedjiga rörelser för att bilda kromoforen. Modellerad R96 (lila) indikerar steriska interaktioner med Y66 sidokedjans läge för precykliseringsmediärstrukturen., d) överlagring av Gly-Gly-Gly-strukturerna före (blå, anaerob) och efter (grön, aerob) peptidcyklisering visar funktionella gruppinteraktioner mellan R96, E222 och T62 karbonylsyreatomer och kromoforrester. e) schematisk distorsion i huvudkedjiga väte-bindningsinteraktioner för WT, Gly-Gly-Gly precyklisering och postcykliseringsstrukturer (vänster) som visas i jämförelse med en kanonisk α-helix (höger). Fasta linjer mellan huvudkedjiga atomer indikerar närvaron av en vätebindning. A-d illustreras med avs (45).,
jämförelser av precykliseringen och mogna chromophore-tillstånden för r96a-strukturerna identifierar både globala och lokala funktioner som driver peptidcyklisering. Trots dramatiska rörelser av kromoforebildande rester, där Y66 fenolisk syreatom flyttar 14 Å och ryggraden atomer Skift 2.6–3.1 Å, rester utanför kromoforen överlappar väl för de tre r96a strukturer (Fig. 2a). Kromoforen är förankrad både av intilliggande hydrofoba rester och hydrofoba interaktioner vid ändarna av den centrala förvrängda helixen (Fig. 2b)., I en sekvens anpassning av 48 GFP homologer (Tabell 2, som publiceras som stödjande information på PNAS webbplats, www.pnas.org), Rest 64, som omedelbart föregår kromoforen, är i huvudsak en hydrofob (41 sekvenser; F, L, V) eller cystein (6 sekvenser) rester. Intressant, alla sekvenser som innehåller C64 innehåller också C29. Kartläggning av dessa cysteinrester på GFP-strukturen (data som inte visas) placerar dem i en rimlig orientering för att bilda en disulfidbindning och tillhandahålla en alternativ förankringsmetod (till hydrofoba interaktioner)., Dessutom gör resterna av denna förvrängda ”helix” i mogna GFP endast tre huvudkedjiga vätebindningar, mellan restpar L60-L64 (α-helix), V61-s65t (α-helix) och V68-F71 (310-helix). R96a-precykliseringsstrukturerna lägger till vätebindningarna T62-Y66 (α-helix) och s65t-V68 (310-helix). Således är de flesta snedvridningarna i den centrala helixen inte en följd av kromoforbildning, utan snarare påläggs av proteinstället., I alla strukturer av GFP (1, 17) och dess röda fluorescerande proteinhomologer (35, 36) en dramatisk 80° böj i helixen (Fig. 2b), som genereras av proteinarkitekturen, är inriktad på kromoforen (Fig. 2c). Den svåra böja utsätter T62 och Y66 carbonyl syre atomer för interaktioner med R96 (se nedan) och tvingar G67 kväve nucleophile och S65T carbonyl syre i närmare kontakt (3,0 och 3,2 Å i två precyclization strukturer) än summan (3.25 Å) av deras van der Waals radier (37), i förberedelse för kovalent bindning bildas under peptid cyclization (Fig. 2c)., Avsevärt eliminerar dessa snedvridningar potentiella spiralformiga vätebindningar som annars måste brytas till en energisk kostnad under cykliseringen. Tillsammans föreslår r96a-strukturerna att GFP-arkitekturen upprätthåller destabiliserande snedvridningar, utesluter en stabil α-spiralformad konformation och skapar ett tillstånd närmare övergångstillståndet för peptidcyklisering., Detta är analogt med det entatiska statsförslaget för metalloproteiner (38), där proteinstället begränsar ett metallcentrum i en destabiliserad geometrisk konformation för att sänka omorganisering av energibarriärer och öka reaktionshastigheterna.
strukturer av S65g Y66G-varianten under aeroba och anaeroba förhållanden. För att undersöka om sidokedjans interaktioner av kromoforrester är kritiska för ryggradscyklisering konstruerade och karakteriserade vi den färglösa s65g Y66G-varianten (sekvens Gly-Gly-Gly för kromoforrester)., Mutationsresultat har visat att nästan alla substitutioner för S65, aromatiska substitutioner för Y66 och WT G67 bildar mogna kromoforer (4). Om den mekaniska kompressionsmodellen för peptidcyklisering (20) eller förslaget att sidokedjeoxidation krävs före cyklisering (22) var korrekt, bör trunkering till Gly-Gly-Gly-Gly-varianten hindra eller utesluta ryggbencyklisering. Anmärkningsvärt visar elektrondensiteten för en 1,80-Å-upplösningsstruktur för denna variant (Tabell 1) att ryggraden är cykliserad., Simulerade glödgning utelämna kartor för denna cykliserade Gly-Gly variant (Fig. 1 D och e) visar att imidazolonringen skiftas 0,7 Å från sin position i Gfpsolstrukturen och modifieras av två nonhydrogenatomer. Den första atomen, s65g karbonylsyre, har inte förlorats som vatten, vilket är fallet för WT GFP. I stället förblir detta syre fäst vid imidazolonringen och bildar en vätebindning med sidokedjan av E222 (Fig. 2d)., Den andra nonhydrogenatomen är kovalent bunden till y66g Ca av den cykliserade ringen och är sannolikt en syreatom införlivad genom en oxidationsreaktion (se Fig. 4, som offentliggörs som stödjande information på PNAS webbplats, för den föreslagna mekanismen). Vi bekräftade att de extra topparna i våra utelämningskartor var verkliga och inte härledda från proteinvarianten genom att ställa om plasmiden, rena en andra sats protein, lösa en andra 2,00-Å-struktur och observera samma toppar i nya utelämningskartor. Elektrondensiteten (Fig., 1d) överensstämmer med ett fem-π-elektron, icke-aromatiskt ringsystem som innehåller en tetraedrisk s65g karbonylkolatom (puckering den cykliserade ringen), en enol tautomer för y66g karbonyl, och en keto tautomer för den nyligen införlivade syreatomen (Fig. 1f). Cyklisering av Gly-Gly-Gly, som inte innehåller några sidokedjaatomer, argumenterar mot den föreslagna modellen där sidokedjaoxidation föregår cyklisering (22).
vi förberedde och kristalliserade s65g Y66G-varianten under anaeroba förhållanden för att utforska det oväntade införlivandet av syre vid Y66G Ca., Överraskande avslöjade den anaeroba strukturen vid 1.80-Å upplösning (Tabell 1) uncykliserade kromoforrester (Fig. 1g). Utanför kromoforen är precykliseringen och postcykliseringen anmärkningsvärda liknande strukturer (Fig. 2d) och dela med WT GFP samma begränsade vätebindning (6 av 24 möjliga huvudkedjeinteraktioner) för den centrala helixen (Fig. 2e). Till och med den extra flexibiliteten i ryggraden som följer av substitutionen av Gly för kromoforaminosyrorna leder således inte till bildandet av ytterligare huvudkedjiga vätebindningar., Bristen på huvudkedjiga vätebindningar för kromoforrester bidrar till de uppenbara låga interkonverteringsbarriärerna och stora lokala omarrangemang för cyklisering som observerats i r96a-strukturerna (ovan). Förvrängningar i precykliseringstillståndet upprätthålls i postcykliseringstillståndet, snarare än lindras av kromoforbildning. Detta argumenterar mot den mekaniska kompressionshypotesen, men understryker vikten av GFP-arkitekturen för att skapa en specifik konformation som gynnar peptidcyklisering.,
de Gly-Gly-Gly strukturella resultaten avslöjar konformationella och energiska egenskaper som är kritiska för peptidcyklisering. Standard main-chain conformations för G67 i både precyklisering (Φ = -90°, = -16°) och postcyklisering (Φ = -90°, = -35°) säger att det uppenbara kravet på G67 i kromoforbildning (4) resulterar från steric snarare än konformationella begränsningar. Faktum är att en modellerad Ala-sidokedja för REST 67 har signifikanta van der Waals kollisioner med T63-karbonylsyret., Ännu viktigare indikerar misslyckandet av Gly-Gly-Gly-sekvensen att cyklisera anaerobt att cyklisering i denna mutant är kopplad till oxidation. Bristen på partiell beläggning av en cykliserad produkt under anaeroba förhållanden tyder på att precykliseringsstrukturen är termodynamiskt stabilare än ett cykliserat men ännu inte oxiderat tillstånd., Oxidation tjänar således till att öka den elektroniska konjugationen av Gly-Gly-Gly-varianten och fånga en termodynamiskt ogynnsam cykliseringsprodukt enligt Le Chateliers princip som en resonansstabiliserad, fem-π-elektron, icke-aromatiska arter.