resulta
estruturas da variante R96a GFPsol antes e depois da ciclização peptídica. Como o R96 foi proposto para ativar o carbonil S65 para ataque nucleofílico (20) ou desprotonar diretamente o amida dorsal G67 (22), nós construímos uma variante R96A e descobrimos que esta mutação de ponto atrasa a reação de ciclização de minutos a meses., Após a purificação da proteína R96A inicialmente incolor, a maturação do cromóforo foi conseguida por incubação durante 3 meses a 37°C. A nossa estrutura cristalográfica de resolução de 1,50-Å desta proteína r96a amadurecida (Tabela 1) é muito semelhante à do seu progenitor gfpsol optimizado em solubilidade, com um desvio Global Ca rms de 0,20 Å. In GFP, R96 forms a hydrogen bond with the imidazolone oxygen of the mature chromophore. No mutante R96A, três moléculas de água enchem o volume normalmente ocupado pela cadeia lateral R96, mas não formam ligações de hidrogênio com o oxigênio imidazolona., Isto pode explicar as mudanças na fluorescência maxima para o R96A variante (468 nm de excitação, 503-nm de emissão) em comparação com GFPsol (489-nm de excitação, 508-nm de emissão), sugerindo que R96 reduz o estado excitado de energia do cromóforo, consistente com resultados não publicados no R96C variante (4). Importante, o cromóforo da variante R96A é completamente amadurecido (Fig. 1-A), demonstrando que este mutante mantém todos os componentes essenciais para a formação de cromóforos.
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Nós utilizado maturação lenta taxa de R96A variante para isolar GFP intermediários antes de cyclization e, assim, determinar dois independentes cristalográfica estruturas (Tabela 1) de GFP antes de posttranslational modificações (Fig. 1 b E c)., Na hipótese da compressão mecânica, as interações estéricas geradas pela arquitetura GFP são propostas para elevar a energia do Estado de pré-ciclização acima da do intermediário ciclizado e relaxar esta conformação tensa impulsiona a formação de cromóforos. Assim, examinamos as estruturas de pré-ciclização r96a de resolução 2.0-Å para evidências de interações estéricas que poderiam ser relaxadas sobre a formação de cromóforos. Em vez disso, a densidade de elétrons revela conformações favoráveis para os resíduos de cromóforo sem colisões significativas de van der Waals., Fora dos resíduos cromóforos, as duas estruturas são altamente similares (Fig. 2a). The Ca atoms superimpose with a rms deviation of 0.28 Å, and side-chain conformational rearrangements are minor. Curiosamente, estas estruturas determinadas independentemente exibem diferentes conformações de cadeia lateral Y66, de ambos os lados da quarta cadeia β(Fig. 1 b E c). Cada pilha com Q94 e ocupa parte da cavidade criada por truncamento R96. Os cristais usados para determinar essas diferentes estruturas intermediárias de pré-cozedura cresceram sob as mesmas condições., Assim, propomos que a proteína possui Estados isoenergéticos para o Y66 com baixas barreiras de energia interconversão e que diferenças sutis de embalagem de cristal podem propagar-se ao núcleo de proteína para selecionar as conformações observadas.Fig. 2.
distorções arquitetônicas e comparações estruturais entre estados de pré-ciclização e pós-ciclização. (a) superposição de estruturas R96A, enfatizando grande mudança conformacional para o Y66, mas de outra forma pequenas diferenças Ca entre a pré-hidratação (A em amarelo, B em azul) e pós-ciclização (verde) Estados., B) hélice Central para três estruturas R96A exibidas com a superfície da estrutura madura R96A, enfatizando a curva helicoidal. c) sobreposição estrutural de pré-ciclização R96A intermedia A (amarelo) e B (azul) com a estrutura r96a (verde) madura, mostrando grandes movimentos da cadeia principal na formação do cromóforo. R96 modelado (roxo) indica interacções estéricas com a posição da cadeia lateral Y66 da estrutura intermédia de pré-cozedura., d) a superposição das estruturas Gly-Gly-Gly-Gly antes (azul, anaeróbica) e depois da ciclização do peptídeo (verde, aeróbica) mostra interacções funcionais entre os átomos de oxigénio R96, E222, e T62 carbonilo e os resíduos de cromóforo. (e) Esquematic of distortions in main-chain hydrogen-bonding interactions for the WT, Gly-Gly-Gly-Gly precyclization, and postcyclization structures (Left) displayed in comparison to a canonical α-helix (Right). As linhas sólidas entre átomos da cadeia principal indicam a presença de uma ligação de hidrogénio. A-d são ilustradas com avs (45).,
comparações da pré-hidratação e dos Estados cromóforos maduros para as estruturas R96A identificam características globais e locais que conduzem à ciclização peptídica. Apesar dos movimentos dramáticos de resíduos de formação de cromóforos, em que o átomo de oxigênio fenólico Y66 move 14 Å e os átomos da coluna vertebral mudam 2,6-3,1 Å, resíduos fora do poço de superimpose cromóforo para as três estruturas R96A (Fig. 2a). O cromóforo é ancorado por resíduos hidrofóbicos adjacentes e interações hidrofóbicas nas extremidades da hélice distorcida central(Fig. 2b)., Num alinhamento sequencial de 48 HOMOLOGS GFP (Quadro 2, que é publicado como informação de apoio no sítio Web PNAS, www.pnas.org), resíduo 64, que imediatamente precede o cromóforo, é essencialmente um resíduo hidrofóbico (41 sequências; F, L, V) ou cisteína (6 sequências). Curiosamente, todas as sequências que contêm C64 também contêm C29. Mapear esses resíduos de cisteína na estrutura GFP (dados não mostrados) coloca-os em uma orientação razoável para formar uma ligação dissulfeto e fornecer um método alternativo de ancoragem (para interações hidrofóbicas)., Além disso, apesar das conformações helicoidais destras em uma parcela de Ramachandran, os resíduos desta “hélice” distorcida em GFP Maduro fazem apenas três ligações de hidrogênio de cadeia principal, entre pares de resíduos L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), e V68-F71 (310-helix). As estruturas de pré-ciclização r96a adicionam as ligações de hidrogênio T62-Y66 (α-helix) e S65T-V68 (310-helix). Assim, a maioria das distorções na hélice central não são uma consequência da formação de cromóforos, mas são impostas pelo andaime proteico., Em todas as estruturas do GFP (1, 17) e seus homólogos da proteína fluorescente vermelha (35, 36) uma curva dramática de cerca de 80° na hélice (Fig. 2b), gerado pela arquitetura proteica, é focado no cromóforo (Fig. 2c). O grave dobrar expõe o T62 e Y66 carbonila de átomos de oxigénio para interações com R96 (ver abaixo) e força o G67 nitrogênio nucleophile e S65T carbonila de oxigênio em contato mais íntimo (3.0 e 3.2 Å nas duas precyclization estruturas) que a soma (3.25 Å) de seus raios de van der Waals (37), em preparação para a ligação covalente bond formação durante o peptídeo cyclization (Fig. 2c)., Significativamente, estas distorções eliminam potenciais ligações helicoidais de hidrogênio que de outra forma teriam que ser quebradas a um custo energético durante a ciclização. Juntos, as estruturas R96A sugerem que a arquitetura GFP impõe distorções desestabilizadoras, impedindo uma conformação α-helical estável e criando um estado mais próximo do Estado de transição para a ciclização peptídica., Isto é análogo à proposta de Estado entático para as metaloproteínas (38), na qual o andaime proteico restringe um centro de metal em uma conformação geométrica desestabilizada para reduzir as barreiras de energia de reorganização e aumentar as taxas de reação.estruturas da variante S65G Y66G em condições aeróbias e anaeróbias. Para examinar se as interações de cadeia lateral dos resíduos de cromóforo são críticas para a ciclização da espinha dorsal, nós construímos e caracterizamos a variante incolor S65G Y66G (sequência Gly-Gly-Gly para resíduos de cromóforo)., Resultados mutacionais estabeleceram que quase qualquer substituição para S65, substituições aromáticas para Y66, e o WT G67 formam cromóforos maduros (4). No entanto, se o modelo de compressão mecânica para a ciclização peptídica (20) ou a proposta de que a oxidação da cadeia lateral é necessária antes da ciclização (22) estavam corretas, a truncação para a variante Gly-Gly-Gly deve impedir ou impedir a ciclização da coluna vertebral. Notavelmente, a densidade de elétrons para uma estrutura de resolução 1.80-Å desta variante (Tabela 1) revela que a espinha dorsal é ciclizada., Simulated annealing omit maps for this cyclized Gly-Gly-Gly variant (Fig. 1 d E e) mostram que o anel de imidazolona é deslocado ≈0.7 Å de sua posição na estrutura GFPsol e modificado por dois átomos não-hidrogenados. O primeiro átomo, o oxigênio s65g carbonila, não foi perdido como água, como é o caso do PAM do TMA. Em vez disso, este oxigénio permanece ligado ao anel da imidazolona e forma uma ligação de hidrogénio com a cadeia lateral de E222 (Fig. 2d)., O segundo átomo não-hidrogenado Está ligado covalentemente ao Y66G Ca do anel ciclizado e é mais provável um átomo de oxigênio incorporado através de uma reação de oxidação (ver Fig. 4, que é publicado como informação de apoio no site PNAS, para o mecanismo proposto). Nós confirmamos que os picos extras em nossos mapas omitidos eram reais e não derivados da variante proteica, ressequenciando o plasmídeo, purificando um segundo lote de proteína, Resolvendo uma segunda estrutura de 2,00-Å, e observando os mesmos Picos em novos mapas omitidos. A densidade dos electrões (Fig., 1d) é consistente com um sistema anelar de cinco-π-elétrons, não-aromáticos, que contém um átomo tetraédrico de carbono S65G carbonila (puckering the cyclized ring), um tautômero de enol para o carbonil Y66G, e um tautômero de ceto para o recém-incorporado átomo de oxigênio (Fig. 1f). Cyclization of Gly-Gly-Gly, which contains no side-chain atoms, argues against the proposed model in which side-chain oxidation precedes cyclization (22).
preparamos e cristalizamos a variante S65G Y66G sob condições anaeróbias para explorar a incorporação inesperada de oxigênio em Y66G Ca., Surpreendentemente, a estrutura anaeróbica a resolução 1.80-Å (Tabela 1) revelou resíduos de cromóforos não cónicos (Fig. 1g). Fora do cromóforo, a pré-ciclização e pós-ciclização estruturas Gly-Gly-Gly são notáveis similares (Fig. 2d) e compartilhar com o WT GFP a mesma ligação limitada de hidrogênio (6 de 24 possíveis interações da cadeia principal) para a hélice central(Fig. 2e). Assim, mesmo a flexibilidade adicional da coluna vertebral conferida pela substituição de Gly pelos aminoácidos cromóforos não resulta na formação de ligações de hidrogênio de cadeia principal adicionais., A falta de ligações de hidrogênio de cadeia principal para os resíduos cromóforos contribui para as aparentes barreiras de energia de interconversão baixa e grandes rearranjos locais de ciclização observados nas estruturas R96A (acima). Distorções no estado de pré-ciclização são mantidas no estado de pós-ciclização, ao invés de aliviadas pela formação de cromóforos. Isto argumenta contra a hipótese de compressão mecânica, mas sublinha a importância da arquitetura GFP na criação de uma conformação específica que favorece a ciclização peptídica.,
os resultados estruturais Gly-Gly-Gly revelam características conformacionais e energéticas críticas à ciclização peptídica. Padrão principal da cadeia de conformações para G67 em ambos os precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) e postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) estados sugere que a aparente requisito para G67 na formação do cromóforo (4) resultados do estéricos, ao invés de incluir conformacional restrições. Na verdade, uma cadeia lateral de Ala modelada para o resíduo 67 tem colisões significativas de van der Waals com o oxigênio carbonila T63., Mais importante, a falha da sequência Gly-Gly-Gly para ciclizar anaeróbicamente indica que a ciclização neste mutante é associada à oxidação. A ausência de qualquer ocupação parcial de um produto ciclizado em condições anaeróbicas sugere que a estrutura de pré-ciclização é termodinamicamente mais estável do que um estado ciclizado, mas ainda não oxidado., Assim, a oxidação serve para aumentar a conjugação eletrônica da variante Gly-Gly-Gly e aprisionar um produto termodinamicamente desfavorável de ciclização de acordo com o princípio de Le Chatelier como uma espécie estabilizada por ressonância, de cinco elétrons π, Não-aromáticos.