Results
Structures of the R96a Gfpsol Variant Before and After Peptide Cyclization. Omdat R96 is voorgesteld om ofwel het S65-carbonyl te activeren voor nucleofiele aanval (20) of het G67-backbone-amide direct te deprotoneren (22), hebben we een r96a-variant geconstrueerd en ontdekten we dat deze puntmutatie de cyclisatiereactie vertraagt van minuten tot maanden., Na zuivering van de aanvankelijk kleurloze r96a proteã ne, werd de chromophore rijping bereikt door incubatie 3 maanden bij 37°C. Onze 1.50-Å resolutie kristallografische structuur van deze gerijpte r96a proteã ne (Tabel 1) is hoogst gelijkaardig aan dat van zijn oplosbaarheid-geoptimaliseerde gfpsol ouder, met een algemene CA rms afwijking van 0,20 Å. In GFP, vormt R96 een waterstofband met de imidazolonezuurstof van rijpe chromophore. In de r96a-mutant vullen drie watermoleculen het volume dat normaal door de R96-zijketen wordt ingenomen, maar vormen geen waterstofbindingen met de imidazolonzuurstof., Dit kan de verschuivingen in fluorescentiemaxima voor de variant R96A verklaren (opwinding 468 nm, emissie 503 nm) die met gfpsol wordt vergeleken (opwinding 489 nm, emissie 508 nm), die voorstellen dat R96 de opgewekte staatsenergie van chromophore verlaagt, consistent met niet-gepubliceerde resultaten op de variant R96C (4). Belangrijk, is chromophore van de variant R96A volledig gerijpt (Fig. 1a), die aantonen dat deze mutant alle essentiële componenten voor chromophore vorming behoudt.
posttranslationele wijzigingen onthuld door structuren van GFP varianten voor en na backbone cyclisatie. Weglaten / Fo-Fc / elektronendichtheidskaarten voor de chromofore residu ‘ s met een contour van 3 σ (zwart). (a) de 1,50-Å cyclische r96a structuur. (b) de 2.00-Å precyclisatie r96a intermediaire a structuur. (C) de intermediaire B-structuur R96a van 2,00-Å-precyclisatie. (d en e) orthogonale weergave van de 1,80-Å Gly-Gly-Gly aërobe geoxideerde postcyclisatiestructuur. f) voorgestelde moleculaire structuur van de gly-Gly-Gly cyclische ring. g) de 1,80-Å Gly-Gly-Gly anaërobe precyclisatiestructuur., Alle zijn geïllustreerd inraster 3d (44).
- inline
- View popup
We gebruikten de langzame rijpingssnelheid van de r96a-variant om GFP-tussenproducten vóór cyclisatie te isoleren en zo twee onafhankelijke kristallografische structuren (Tabel 1) van GFP te bepalen vóór posttranslationele wijzigingen (Fig. 1 b en c)., In de mechanische compressiehypothese, worden de sterische interactie voorgesteld die door de GFP-architectuur worden geproduceerd om de energie van de precyclisatiestaat boven dat van de cyclized tussenpersoon op te heffen en deze gespannen Bouw drijft chromophore vorming te ontspannen. Aldus, onderzochten wij de 2.0-Å resolutier96a precyclisatiestructuren voor bewijsmateriaal van steric interactie die op chromophore vorming konden worden ontspannen. In plaats daarvan, onthult de elektronendichtheid gunstige conformaties voor de chromophoreresidu ‘ s zonder significante Van der Waals-botsingen., Buiten de chromophore residuen, zijn de twee structuren hoogst gelijkaardig (Fig. 2 bis). De Ca-atomen superponeren met een RMS-afwijking van 0,28 Å, en zijketens conformationele herschikkingen zijn klein. Interessant is dat deze onafhankelijk bepaalde structuren verschillende Y66 zijketens vertonen, die aan weerszijden van de vierde β-streng liggen (Fig. 1 b en c). Elke stapels met Q94 en neemt een deel van de holte die door afkappen R96. De kristallen die werden gebruikt om deze verschillende tussenstructuren voor de precyclisatie te bepalen groeiden onder dezelfde omstandigheden., Aldus stellen wij voor dat de proteã ne ISO-energetische Staten voor Y66 met lage interconversieenergiebarrières bezit en dat subtiele kristalverpakkingsverschillen zich aan de proteã nekern kunnen verspreiden om de waargenomen conformaties te selecteren.
architecturale vervormingen en structurele vergelijkingen tussen precyclisatie en postcyclisatie toestanden. (a) superpositie van r96a structuren, met nadruk op grote conformationele verandering voor Y66 maar verder kleine Ca verschillen tussen precyclisatie (A in geel, B in blauw) en postcyclisatie (groen) Staten., (B) Centrale helix voor drie r96a structuren weergegeven met het oppervlak van de r96a Rijpe structuur, met nadruk op spiraalvormige bocht. (C) structurele overlay van r96a precyclisatie tussenpersonen a (geel) en B (blauw) met de rijpe (groene) structuur van R96A, die grote hoofdketenbewegingen in het vormen van chromophore tonen. Gemodelleerd R96 (paars) geeft sterische interacties aan met de Y66 zijketenpositie van de tussenstructuur voor precyclisatie., (d) superpositie van de gly-Gly-Gly structuren voor (blauw, anaërobe) en na (groen, aërobe) peptide cyclisatie toont functionele groepsinteracties tussen de carbonylzuurstofatomen R96, E222 en T62 en de chromofore residuen. (e) schema van vervormingen in waterstofbindingsinteracties in de hoofdketen voor de WT -, Gly-Gly-gly-precyclisatie-en postcyclisatiestructuren (links) weergegeven in vergelijking met een canonieke α-helix (rechts). Vaste lijnen tussen hoofdketenatomen wijzen op de aanwezigheid van een waterstofbinding. a-d worden geïllustreerd met avs (45).,
vergelijkingen van de precyclisatie en volwassen chromofore toestanden voor de r96a structuren identificeren zowel globale als lokale kenmerken die peptide cyclisatie aandrijven. Ondanks dramatische bewegingen van chromofore-vormende residu ‘s, waarin het Y66 fenolzuurstofatoom 14 Å beweegt en backbone atomen 2.6–3.1 Å verschuiven, liggen de residu’ s buiten de chromofore goed boven elkaar voor de drie r96a structuren (Fig. 2 bis). Chromophore is verankerd zowel door aangrenzende hydrophobic residuen en hydrophobic interactie bij de einden van de centrale vervormde helix (Fig. 2b)., In een sequentieuitlijning van 48 GFP-homologen (Tabel 2, die wordt gepubliceerd als ondersteunende informatie op de PNAS-website; www.pnas.org), residu 64, die onmiddellijk chromophore voorafgaat, is hoofdzakelijk hydrophobic (41 opeenvolgingen; F, L, V) of cysteine (6 opeenvolgingen) residu. Interessant is dat alle sequenties die C64 bevatten ook C29 bevatten. Het in kaart brengen van deze cysteine residuen op de GFP structuur (getoonde gegevens niet) plaatst hen in een redelijke oriëntatie om een disulfideband te vormen en een alternatieve verankerende methode (aan hydrophobic interactie) te verstrekken., Bovendien, ondanks rechtshandige spiraalvormige conformaties in een Ramachandran plot, maken de residuen van deze vervormde “helix” in volwassen GFP slechts drie hoofdketens waterstofbindingen, tussen residuparen L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), en V68-F71 (310-helix). De r96a-precyclisatiestructuren voegen de waterstofbindingen T62-Y66 (α-helix) en s65t-V68 (310-helix) toe. Aldus, zijn de meeste vervormingen in de centrale helix geen gevolg van chromophorevorming, maar eerder opgelegd door de eiwitsteiger., In alle structuren van GFP (1, 17) en zijn rode fluorescente eiwithomologen (35, 36) een dramatische ≈80° bocht in de helix (Fig. 2b), geproduceerd door de eiwitarchitectuur, wordt geconcentreerd bij chromophore (Fig. 2c). De ernstige bocht stelt de T62-en Y66-carbonylzuurstofatomen bloot voor interacties met R96 (zie hieronder) en dwingt de G67-stikstofnucleofiel en s65t-carbonylzuurstof in nauwer contact (3,0 en 3,2 Å in de twee precyclisatiestructuren) dan de som (3,25 Å) van hun Van der Waals-stralen (37), ter voorbereiding op covalente bindingsvorming tijdens peptidecyclisatie (Fig. 2c)., Belangrijk is dat deze vervormingen elimineren potentiële spiraalvormige waterstof bindingen die anders zou moeten worden gebroken tegen een energetische kosten tijdens cyclisatie. Samen, stellen de structuren R96A voor dat de GFP-architectuur destabiliserende verstoringen afdwingt, die een stabiele α-spiraalvormige Bouw uitsluiten en een staat dichter bij de overgangsstaat voor peptide cyclisatie creëren., Dit is analoog aan het entatic state-voorstel voor metalloproteïnen (38), waarin de eiwitsteiger een metalen centrum in een gedestabiliseerde geometrische constructie beperkt tot lagere reorganisatieenergie-barrières en de reactiesnelheid verhoogt.
structuren van de S65g Y66G-Variant onder aerobe en anaerobe omstandigheden. Om te onderzoeken of zijketeninteracties van de chromophoreresidu ’s kritiek zijn op backbone cyclisatie, construeerden en kenmerkten wij de kleurloze variant van S65G Y66G (opeenvolging Gly-Gly-Gly voor chromophoreresidu’ s)., Mutationele resultaten hebben aangetoond dat bijna elke substitutie voor S65, aromatische substituties voor Y66 en de WT G67 volwassen chromoforen vormen (4). Als het mechanische compressiemodel voor peptidecyclisatie (20) of het voorstel dat zijketenoxidatie vereist is vóór cyclisatie (22) echter correct waren, zou afkappen naar de gly-Gly-Gly variant de backbone cyclisatie moeten belemmeren of uitsluiten. Opmerkelijk is dat de elektronendichtheid voor een 1.80-Å resolutiestructuur van deze variant (Tabel 1) laat zien dat de ruggengraat cyclisch is., Gesimuleerde gloeien weglaten kaarten voor deze cyclische gly-Gly-Gly variant (Fig. 1 d en e) tonen aan dat de imidazolonring ≈0.7 Å van zijn positie in de gfpsolstructuur wordt verschoven en door twee niet-waterstofatomen wordt gewijzigd. Het eerste atoom, de s65g carbonylzuurstof, is niet verloren als water, zoals het geval is voor WT GFP. In plaats daarvan blijft deze zuurstof gehecht aan de imidazolonring en vormt een waterstofbinding met de zijketen van E222 (Fig. 2d)., Het tweede niet-waterstofatoom is covalent gebonden aan de Y66G Ca van de cyclische ring en is hoogstwaarschijnlijk een zuurstofatoom opgenomen door een oxidatiereactie (zie Fig. 4, die wordt gepubliceerd als ondersteunende informatie op de PNAS-website, voor het voorgestelde mechanisme). We bevestigden dat de extra pieken in onze weglaten kaarten echt waren en niet afgeleid van de eiwitvariant door het plasmide te herschikken, een tweede partij eiwit te zuiveren, een tweede 2.00-Å structuur op te lossen en dezelfde pieken in nieuwe weglaten kaarten te observeren. De elektronendichtheid (Fig., 1d) is consistent met een vijf-π-elektron, niet-aromatisch ringsysteem dat een tetrahedraal s65g carbonyl koolstofatoom (Pucking de cyclische ring), een enol tautomeer voor de y66g carbonyl, en een keto tautomeer voor het nieuw opgenomen zuurstofatoom (Fig. 1f). Cyclisatie Van Gly-Gly-Gly, die geen zijketenatomen bevat, pleit tegen het voorgestelde model waarin zijketenoxidatie voorafgaat aan cyclisatie (22).
We bereidden en kristalliseerden de s65g Y66G variant onder anaerobe omstandigheden om de onverwachte incorporatie van zuurstof bij Y66G Ca., Verrassend genoeg onthulde de anaërobe structuur bij 1,80-Å resolutie (Tabel 1) ongecycliseerde chromofore residuen (Fig. 1g). Buiten de chromofoor zijn de precyclisatie en postcyclisatie gly-Gly-Gly structuren opmerkelijk vergelijkbaar (Fig. 2d) en delen met WT GFP dezelfde beperkte waterstofbinding (6 van 24 mogelijke hoofdketeninteracties) voor de centrale helix (Fig. 2e). Aldus, leidt zelfs de toegevoegde die backbone flexibiliteit door de substitutie van Gly voor de chromophore aminozuren wordt verleend niet in de vorming van extra de banden van de hoofdketen waterstof., Het gebrek aan waterstofbindingen van de hoofdketens voor de chromofore-residuen draagt bij tot de schijnbare lage energiebarrières en grote lokale herschikkingen voor cyclisatie die in de R96A-structuren (hierboven) worden waargenomen. De vervormingen in de precyclisatiestaat worden gehandhaafd in de postcyclisatiestaat, eerder dan verlicht door chromophore vorming. Dit stelt tegen de mechanische compressiehypothese, maar onderstreept het belang van de GFP-architectuur in het creëren van een specifieke bouw die peptide cyclisatie begunstigt.,
De gly-Gly-Gly structurele resultaten onthullen conformationele en energetische kenmerken die cruciaal zijn voor peptidecyclisatie. Standaard hoofdketenconformaties voor G67 in zowel precyclisatie (Φ = -90°, Ψ = -16°) als postcyclisatie (Φ = -90°, Ψ = -35°) stelt voor dat de schijnbare eis voor G67 in chromophorevorming (4) voortvloeit uit sterische eerder dan conformational beperkingen. In feite heeft een gemodelleerde Ala zijketen voor residu 67 significante Van der Waals botsingen met de T63 carbonylzuurstof., Belangrijker, het falen van de gly-Gly-Gly opeenvolging om anaeroob te cycliseren wijst erop dat cyclisatie in deze mutant aan oxidatie wordt gekoppeld. Het ontbreken van een gedeeltelijke bezetting van een cyclisch product onder anaërobe omstandigheden suggereert dat de precyclisatiestructuur thermodynamisch stabieler is dan een cyclisch maar nog niet geoxideerde toestand., Oxidatie dient dus om de elektronische conjugatie van de gly-Gly-Gly variant te verhogen en een thermodynamisch ongunstig cyclisatieproces op te vangen volgens het principe van Le Chatelier als een resonantie-gestabiliseerde, vijf-π-elektron, niet-aromatische soort.