Risultati
Strutture della variante R96A GFPsol prima e dopo la ciclizzazione del peptide. Poiché R96 è stato proposto di attivare il carbonile S65 per l’attacco nucleofilo (20) o deprotonare direttamente l’ammide dorsale G67 (22), abbiamo costruito una variante R96A e abbiamo scoperto che questa mutazione puntiforme rallenta la reazione di ciclizzazione da minuti a mesi., Dopo la purificazione della proteina R96A inizialmente incolore, la maturazione del cromoforo è stata ottenuta mediante incubazione per 3 mesi a 37°C. La nostra struttura cristallografica di risoluzione 1.50-Å di questa proteina R96A matura (Tabella 1) è altamente simile a quella del suo genitore GFPsol ottimizzato per la solubilità, con una deviazione Ca rms complessiva di 0.20 Å. In GFP, R96 forma un legame idrogeno con l’ossigeno imidazolone del cromoforo maturo. Nel mutante R96A, tre molecole d’acqua riempiono il volume normalmente occupato dalla catena laterale R96 ma non riescono a formare legami idrogeno con l’ossigeno imidazolone., Ciò potrebbe spiegare i cambiamenti nei massimi di fluorescenza per la variante R96A (eccitazione a 468 nm, emissione a 503 nm) rispetto a GFPsol (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm), suggerendo che R96 abbassa l’energia dello stato eccitato del cromoforo, coerente con risultati inediti sulla variante R96C (4). È importante sottolineare che il cromoforo della variante R96A è completamente maturato (Fig. 1a), dimostrando che questo mutante conserva tutti i componenti essenziali per la formazione del cromoforo.
Modifiche post-traduttive rivelate da strutture di varianti GFP prima e dopo la ciclizzazione della spina dorsale. Omettere| Fo-Fc / mappe di densità elettronica per i residui cromofori sagomati a 3 σ (nero). (a) La struttura ciclizzata R96A da 1,50 Å. (b) La preciclizzazione 2.00-Å R96A intermedio A struttura. (c) La struttura intermedia B di preciclizzazione R96A da 2,00 Å. (d ed e) Viste ortogonali della struttura di postciclizzazione ossidata aerobica di 1.80-Å Gly-Gly-Gly. (f) Struttura molecolare proposta dell’anello ciclizzato Gly-Gly-Gly. (g) La struttura di preciclizzazione anaerobica 1.80-Å Gly-Gly-Gly., Tutti sono illustrati inraster 3d (44).
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Abbiamo utilizzato il tasso di maturazione lento della variante R96A per isolare gli intermedi GFP prima della ciclizzazione e quindi determinare due strutture cristallografiche indipendenti (Tabella 1) di GFP prima delle modifiche posttranslazionali (Fig. 1 b e c)., Nell’ipotesi di compressione meccanica, le interazioni steriche generate dall’architettura GFP sono proposte per aumentare l’energia dello stato di preciclizzazione al di sopra di quella dell’intermedio ciclizzato e rilassare questa conformazione tesa guida la formazione di cromofori. Pertanto, abbiamo esaminato le strutture di preciclizzazione R96A con risoluzione 2.0-Å per la prova di interazioni steriche che potrebbero essere rilassate sulla formazione di cromofori. Invece, la densità elettronica rivela conformazioni favorevoli per i residui di cromoforo senza significative collisioni di van der Waals., Al di fuori dei residui cromofori, le due strutture sono molto simili (Fig. 2 bis). Gli atomi di Ca si sovrappongono con una deviazione rms di 0,28 Å e i riarrangiamenti conformazionali della catena laterale sono minori. È interessante notare che queste strutture determinate in modo indipendente presentano conformazioni distinte della catena laterale Y66, che si trovano su entrambi i lati del quarto filamento β (Fig. 1 b e c). Ogni stack con Q94 e occupa parte della cavità creata troncando R96. I cristalli utilizzati per determinare queste diverse strutture intermedie di preciclizzazione sono cresciuti nelle stesse condizioni., Pertanto, proponiamo che la proteina possieda stati isoenergetici per Y66 con barriere energetiche a bassa interconversione e che sottili differenze di imballaggio dei cristalli possano propagarsi al nucleo della proteina per selezionare le conformazioni osservate.
Distorsioni architettoniche e confronti strutturali tra stati di preciclizzazione e postciclizzazione. (a) Sovrapposizione di strutture R96A, enfatizzando un grande cambiamento conformazionale per Y66 ma per il resto piccole differenze Ca tra preciclizzazione (A in giallo, B in blu) e postciclizzazione (verde) stati., (b) Elica centrale per tre strutture R96A visualizzate con la superficie della struttura matura R96A, enfatizzando la curva elicoidale. (c) Sovrapposizione strutturale di intermedi di preciclizzazione R96A A (giallo) e B (blu) con la struttura matura R96A (verde), che mostra grandi movimenti della catena principale nella formazione del cromoforo. R96 modellato (viola) indica interazioni steriche con la posizione della catena laterale Y66 della struttura intermedia di preciclizzazione., (d) La sovrapposizione delle strutture Gly-Gly-Gly prima (blu, anaerobica) e dopo (verde, aerobica) la ciclizzazione del peptide mostra interazioni di gruppo funzionali tra gli atomi di ossigeno carbonilico R96, E222 e T62 e i residui di cromoforo. (e) Schema delle distorsioni nelle interazioni idrogeno-legame della catena principale per la preciclizzazione WT, Gly-Gly-Gly e strutture di postciclizzazione (a sinistra) visualizzate rispetto a una α-elica canonica (a destra). Le linee continue tra gli atomi della catena principale indicano la presenza di un legame idrogeno. a-d sono illustrati con avs (45).,
I confronti della preciclizzazione e degli stati cromofori maturi per le strutture R96A identificano sia le caratteristiche globali che locali che guidano la ciclizzazione del peptide. Nonostante i movimenti drammatici di residui cromofori che formano, in cui l’atomo di ossigeno fenolico Y66 si muove di 14 Å e gli atomi della spina dorsale si spostano di 2,6 – 3,1 Å, i residui al di fuori del cromoforo si sovrappongono bene per le tre strutture R96A (Fig. 2 bis). Il cromoforo è ancorato sia da residui idrofobici adiacenti che da interazioni idrofobiche alle estremità dell’elica distorta centrale (Fig. 2 ter)., In un allineamento sequenziale di 48 omologhi GFP (Tabella 2, pubblicata come informazioni di supporto sul sito web PNAS, www.pnas.org), residuo 64, che precede immediatamente il cromoforo, è essenzialmente un residuo idrofobo (41 sequenze; F, L, V) o cisteina (6 sequenze). È interessante notare che tutte le sequenze che contengono C64 contengono anche C29. La mappatura di questi residui di cisteina sulla struttura GFP (dati non mostrati) li pone in un orientamento ragionevole per formare un legame disolfuro e fornire un metodo di ancoraggio alternativo (alle interazioni idrofobiche)., Inoltre, nonostante le conformazioni elicoidali destrorse in un terreno Ramachandran, i residui di questa “elica” distorta nella GFP matura formano solo tre legami idrogeno a catena principale, tra coppie di residui L60-L64 (α-elica), V61-S65T (α-elica) e V68-F71 (310-elica). Le strutture di preciclizzazione R96A aggiungono i legami idrogeno T62-Y66 (α-elica) e S65T-V68 (310-elica). Pertanto, la maggior parte delle distorsioni nell’elica centrale non sono una conseguenza della formazione di cromofori, ma piuttosto sono imposte dallo scaffold proteico., In tutte le strutture di GFP (1, 17) e dei suoi omologhi delle proteine fluorescenti rosse (35, 36) una drammatica ≈80° curva nell’elica (Fig. 2b), generato dall’architettura proteica, è focalizzato sul cromoforo (Fig. 2 quater). La curva severa espone gli atomi di ossigeno carbonilico T62 e Y66 per le interazioni con R96 (vedi sotto) e costringe il nucleofilo dell’azoto G67 e l’ossigeno carbonilico S65T a contatto più stretto (3.0 e 3.2 Å nelle due strutture di preciclizzazione) rispetto alla somma (3.25 Å) dei loro raggi di van der Waals (37), in preparazione alla formazione di legami covalenti 2 quater)., Significativamente, queste distorsioni eliminano potenziali legami idrogeno elicoidali che altrimenti dovrebbero essere rotti a un costo energetico durante la ciclizzazione. Insieme, le strutture R96A suggeriscono che l’architettura GFP impone distorsioni destabilizzanti, precludendo una conformazione α-elicoidale stabile e creando uno stato più vicino allo stato di transizione per la ciclizzazione del peptide., Questo è analogo alla proposta di stato entatico per le metalloproteine (38), in cui lo scaffold proteico vincola un centro metallico in una conformazione geometrica destabilizzata per abbassare le barriere energetiche di riorganizzazione e aumentare le velocità di reazione.
Strutture della variante S65G Y66G in condizioni aerobiche e anaerobiche. Per esaminare se le interazioni a catena laterale dei residui di cromoforo sono fondamentali per la ciclizzazione della spina dorsale, abbiamo costruito e caratterizzato la variante S65G Y66G incolore (sequenza Gly-Gly-Gly per i residui di cromoforo)., I risultati mutazionali hanno stabilito che quasi tutte le sostituzioni per S65, le sostituzioni aromatiche per Y66 e il WT G67 formano cromofori maturi (4). Tuttavia, se il modello di compressione meccanica per la ciclizzazione del peptide (20) o la proposta che l’ossidazione della catena laterale è richiesta prima della ciclizzazione (22) fosse corretta, il troncamento alla variante Gly-Gly-Gly dovrebbe ostacolare o precludere la ciclizzazione della spina dorsale. Sorprendentemente, la densità elettronica per una struttura di risoluzione 1.80-Å di questa variante (Tabella 1) rivela che la spina dorsale è ciclizzata., Ricottura simulata omettere mappe per questa variante ciclizzata Gly-Gly-Gly (Fig. 1 d ed e) mostrano che l’anello imidazolone è spostato ≈0,7 Å dalla sua posizione nella struttura GFPsol e modificato da due atomi non idrogeni. Il primo atomo, l’ossigeno carbonilico S65G, non è stato perso come acqua, come nel caso di WT GFP. Invece, questo ossigeno rimane attaccato all’anello di imidazolone e forma un legame idrogeno con la catena laterale di E222 (Fig. 2d)., Il secondo atomo non idrogeno è legato covalentemente al Ca Y66G dell’anello ciclizzato ed è molto probabilmente un atomo di ossigeno incorporato attraverso una reazione di ossidazione(vedi Fig. 4, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS, per il meccanismo proposto). Abbiamo confermato che i picchi extra nelle nostre mappe di omissione erano reali e non derivati dalla variante proteica risequenziando il plasmide, purificando un secondo lotto di proteine, risolvendo una seconda struttura di 2.00-Å e osservando gli stessi picchi nelle nuove mappe di omissione. La densità elettronica (Fig., 1d) è coerente con un sistema di anelli nonaromatici a cinque elettroni π che contiene un atomo di carbonio carbonilico tetraedrico S65G (che raggrinzisce l’anello ciclizzato), un tautomero enol per il carbonile Y66G e un tautomero cheto per l’atomo di ossigeno appena incorporato (Fig. 1f). La ciclizzazione di Gly-Gly-Gly, che non contiene atomi a catena laterale, argomenta contro il modello proposto in cui l’ossidazione a catena laterale precede la ciclizzazione (22).
Abbiamo preparato e cristallizzato la variante S65G Y66G in condizioni anaerobiche per esplorare l’incorporazione inaspettata di ossigeno a Y66G Ca., Sorprendentemente, la struttura anaerobica a risoluzione 1.80-Å (Tabella 1) ha rivelato residui cromofori non ciclizzati (Fig. 1g). Al di fuori del cromoforo, le strutture di preciclizzazione e postciclizzazione Gly-Gly-Gly sono notevoli simili (Fig. 2d) e condividere con WT GFP lo stesso legame idrogeno limitato (6 delle 24 possibili interazioni della catena principale) per l’elica centrale (Fig. 2e). Pertanto, anche la maggiore flessibilità della spina dorsale conferita dalla sostituzione di Gly per gli amminoacidi cromofori non comporta la formazione di ulteriori legami idrogeno a catena principale., La mancanza di legami idrogeno a catena principale per i residui di cromoforo contribuisce alle apparenti barriere energetiche a bassa interconversione e ai grandi riarrangiamenti locali per la ciclizzazione osservati nelle strutture R96A (sopra). Le distorsioni nello stato di preciclizzazione sono mantenute nello stato di postciclizzazione, piuttosto che alleviate dalla formazione di cromofori. Questo argomenta contro l’ipotesi di compressione meccanica, ma sottolinea l’importanza dell’architettura GFP nella creazione di una conformazione specifica che favorisce la ciclizzazione del peptide.,
I risultati strutturali Gly-Gly-Gly rivelano caratteristiche conformazionali ed energetiche critiche alla ciclizzazione dei peptidi. Le conformazioni standard della catena principale per G67 in entrambi gli stati di preciclizzazione (Φ = -90°, Ψ = -16°) e postciclizzazione (Φ = -90°, Ψ = -35°) suggeriscono che il requisito apparente per G67 nella formazione di cromofori (4) deriva da restrizioni steriche piuttosto che conformazionali. In effetti, una catena laterale Ala modellata per il residuo 67 ha significative collisioni di van der Waals con l’ossigeno carbonilico T63., Ancora più importante, il fallimento della sequenza Gly-Gly-Gly di ciclizzare anaerobicamente indica che la ciclizzazione in questo mutante è accoppiata all’ossidazione. La mancanza di qualsiasi occupazione parziale di un prodotto ciclizzato in condizioni anaerobiche suggerisce che la struttura di preciclizzazione è termodinamicamente più stabile di uno stato ciclizzato ma non ancora ossidato., Pertanto, l’ossidazione serve ad aumentare la coniugazione elettronica della variante Gly-Gly-Gly e intrappolare un prodotto di ciclizzazione termodinamicamente sfavorevole secondo il principio di Le Chatelier come una specie non aromatica stabilizzata a risonanza, cinque-π-elettrone.