Résultats
Structures de la Variante R96A GFPsol Avant et Après Cyclisation Peptidique. Étant donné que R96 a été proposé pour activer le carbonyle S65 pour une attaque nucléophile (20) ou déprotoner directement l’amide dorsal G67 (22), nous avons construit une variante R96A et découvert que cette mutation ponctuelle ralentit la réaction de cyclisation de quelques minutes à plusieurs mois., Après purification de la protéine R96A initialement incolore, la maturation des chromophores a été obtenue par incubation pendant 3 mois à 37°C. Notre structure cristallographique de résolution de 1,50 Å de cette protéine R96A mûrie (tableau 1) est très similaire à celle de son parent GFPsol optimisé pour la solubilité, avec un écart global Ca rms de 0,20 Å. Dans le GFP, R96 forme une liaison hydrogène avec l’oxygène imidazolone du chromophore mature. Dans le mutant R96A, trois molécules d’eau remplissent le volume normalement occupé par la chaîne latérale R96 mais ne parviennent pas à former des liaisons hydrogène avec l’oxygène imidazolone., Ceci peut expliquer les changements dans les maxima de fluorescence pour la variante R96A (excitation de 468 nm, émission de 503 nm) par rapport au GFPsol (excitation de 489 nm, émission de 508 nm), suggérant que R96 abaisse l’énergie d’état excité du chromophore, ce qui concorde avec des résultats non publiés sur la variante R96C (4). Fait important, le chromophore de la variante R96A est complètement mûri (Fig. 1a), démontrant que ce mutant conserve tous les composants essentiels à la formation des chromophores.
Modifications post-traductionnelles révélées par les structures des variants GFP avant et après la cyclisation backbone. Omettre| Fo – Fc / cartes de densité électronique pour les résidus de chromophore profilés à 3 σ (noir). a) La structure R96A cyclisée à 1,50 Å. b) La structure intermédiaire A de précyclisation R96A de 2,00 Å. c) La structure intermédiaire B de précyclisation R96A de 2,00 Å. (d et e) Vues orthogonales de la structure de postcyclisation oxydée aérobie Gly-Gly-Gly-Gly de 1,80 Å. (f) Structure moléculaire proposée du cycle cyclisé Gly-Gly-Gly. g) La structure de précyclisation anaérobie Gly-Gly-Gly de 1,80 Å., Tous sont illustrés dansraster 3d (44).
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Nous avons utilisé le taux de maturation lente de la variante R96A pour isoler les intermédiaires de GFP avant cyclisation et ainsi déterminer deux structures cristallographiques indépendantes (Tableau 1) de GFP avant les modifications post-traductionnelles (Fig. 1 b et c)., Dans l’hypothèse de compression mécanique, les interactions stériques générées par l’architecture GFP sont proposées pour élever l’énergie de l’état de précyclisation au-dessus de celle de l’intermédiaire cyclisé et la relaxation de cette conformation tendue entraîne la formation de chromophores. Ainsi, nous avons examiné les structures de précyclisation R96A à résolution 2,0 Å pour trouver des preuves d’interactions stériques qui pourraient être détendues lors de la formation de chromophores. Au lieu de cela, la densité électronique révèle des conformations favorables pour les résidus de chromophore sans collisions significatives de van der Waals., En dehors des résidus chromophores, les deux structures sont très similaires (Fig. 2a). Les atomes de Ca se superposent avec un écart rms de 0,28 Å, et les réarrangements conformationnels des chaînes latérales sont mineurs. Il est intéressant de noter que ces structures déterminées indépendamment présentent des conformations distinctes de la chaîne latérale Y66, situées de part et d’autre du quatrième brin β (Fig. 1 b et c). Chaque pile avec Q94 et occupe une partie de la cavité créée en tronquant R96. Les cristaux utilisés pour déterminer ces différentes structures intermédiaires de précyclisation ont grandi dans les mêmes conditions., Ainsi, nous proposons que la protéine possède des états isoénergétiques pour Y66 avec de faibles barrières énergétiques d’interconversion et que de subtiles différences d’emballage cristallin peuvent se propager au cœur de la protéine pour sélectionner les conformations observées.
Distorsions architecturales et comparaisons structurelles entre les états de précyclisation et de postcyclisation. (a) Superposition des structures R96A, mettant l’accent sur un changement conformationnel important pour Y66, mais sinon de petites différences de Ca entre les états de précyclisation (A en jaune, B en bleu) et de postcyclisation (vert)., (b) Hélice centrale pour trois structures R96A affichée avec la surface de la structure mature R96A, mettant l’accent sur la courbure hélicoïdale. (c) Superposition structurelle des intermédiaires de précyclisation R96A A (jaune) et B (bleu) avec la structure mature R96A (vert), montrant de grands mouvements de la chaîne principale dans la formation du chromophore. Le modèle R96 (violet) indique des interactions stériques avec la position de la chaîne latérale Y66 de la structure intermédiaire de précyclisation., (d) La superposition des structures Gly-Gly-Gly avant (bleu, anaérobie) et après (vert, aérobie) la cyclisation peptidique montre des interactions de groupe fonctionnel entre les atomes d’oxygène carbonyle R96, E222 et T62 et les résidus de chromophore. e) Schéma des distorsions dans les interactions hydrogène-liaison de la chaîne principale pour les structures WT, Gly-Gly-Gly précyclisation et postcyclisation (à gauche) affichées par rapport à une hélice α canonique (à droite). Les lignes solides entre les atomes de la chaîne principale indiquent la présence d’une liaison hydrogène. a-d sont illustrés par avs (45).,
Les comparaisons des états de précyclisation et de chromophore matures pour les structures R96A identifient à la fois des caractéristiques globales et locales qui conduisent à la cyclisation peptidique. Malgré les mouvements spectaculaires des résidus formant des chromophores, dans lesquels l’atome d’oxygène phénolique Y66 se déplace de 14 Å et les atomes de l’épine dorsale se déplacent de 2,6 à 3,1 Å, les résidus à l’extérieur du chromophore se superposent bien pour les trois structures R96A (Fig. 2a). Le chromophore est ancré à la fois par des résidus hydrophobes adjacents et des interactions hydrophobes aux extrémités de l’hélice déformée centrale (Fig. 2b)., Dans un alignement séquentiel de 48 homologues GFP (tableau 2, qui est publié à l’appui sur le site Web des PNAS, www.pnas.org), le résidu 64, qui précède immédiatement le chromophore, est essentiellement un résidu hydrophobe (41 séquences; F, L, V) ou cystéine (6 séquences). Fait intéressant, toutes les séquences contenant C64 contiennent également C29. La cartographie de ces résidus de cystéine sur la structure GFP (données non représentées) les place dans une orientation raisonnable pour former une liaison disulfure et fournir une méthode d’ancrage alternative (aux interactions hydrophobes)., De plus, malgré les conformations hélicoïdales droitières dans une parcelle de Ramachandran, les résidus de cette « hélice” déformée dans le GFP mature ne font que trois liaisons hydrogène de la chaîne principale, entre les paires de résidus L60-L64 (hélice α), V61-S65T (hélice α) et V68-F71 (hélice 310). Les structures de précyclisation R96A ajoutent les liaisons hydrogène T62-Y66 (hélice α) et S65T-V68 (hélice 310). Ainsi, la plupart des distorsions dans l’hélice centrale ne sont pas une conséquence de la formation de chromophores, mais sont plutôt imposées par l’échafaudage protéique., Dans toutes les structures de GFP (1, 17) et de ses homologues de protéines fluorescentes rouges (35, 36), une courbure spectaculaire ≈80° de l’hélice (Fig. 2b), généré par l’architecture protéique, est focalisé au chromophore (Fig. 2c). La courbure sévère expose les atomes d’oxygène carbonyle T62 et Y66 aux interactions avec R96 (voir ci-dessous) et force le nucléophile de l’azote G67 et l’oxygène carbonyle S65T à un contact plus étroit (3,0 et 3,2 Å dans les deux structures de précyclisation) que la somme (3,25 Å) de leurs rayons de van der Waals (37), en vue de la formation de liaisons covalentes pendant la cyclisation peptidique (Fig. 2c)., De manière significative, ces distorsions éliminent les liaisons hydrogène hélicoïdales potentielles qui devraient autrement être rompues à un coût énergétique lors de la cyclisation. Ensemble, les structures R96A suggèrent que l’architecture GFP impose des distorsions déstabilisantes, empêchant une conformation α-hélicoïdale stable et créant un état plus proche de l’état de transition pour la cyclisation peptidique., Ceci est analogue à la proposition d’état entatique pour les métalloprotéines (38), dans laquelle l’échafaudage protéique contraint un centre métallique dans une conformation géométrique déstabilisée pour abaisser les barrières énergétiques de réorganisation et augmenter les vitesses de réaction.
Structures de la variante S65G Y66G Dans des conditions Aérobies et Anaérobies. Pour déterminer si les interactions en chaîne latérale des résidus de chromophore sont essentielles à la cyclisation de l’épine dorsale, nous avons construit et caractérisé la variante incolore S65G Y66G (séquence Gly-Gly-Gly pour les résidus de chromophore)., Les résultats mutationnels ont établi que presque toutes les substitutions pour S65, les substitutions aromatiques pour Y66 et le WT G67 forment des chromophores matures (4). Cependant, si le modèle de compression mécanique pour la cyclisation peptidique (20) ou la proposition selon laquelle l’oxydation de la chaîne latérale est nécessaire avant la cyclisation (22) étaient corrects, la troncation à la variante Gly-Gly-Gly devrait entraver ou empêcher la cyclisation dorsale. Remarquablement, la densité électronique pour une structure de résolution de 1,80 Å de cette variante (tableau 1) révèle que l’épine dorsale est cyclisée., Recuit simulé omettre les cartes pour cette variante de Gly-Gly-Gly cyclisée (Fig. 1 d et e) montrent que le cycle imidazolone est décalé ≈0,7 Å de sa position dans la structure GFPsol et modifié par deux atomes de nonhydrogène. Le premier atome, le carbonyle oxygène S65G, n’a pas été perdu sous forme d’eau, comme c’est le cas pour WT GFP. Au lieu de cela, cet oxygène reste attaché au cycle imidazolone et forme une liaison hydrogène avec la chaîne latérale de E222 (Fig. 2d)., Le deuxième atome de nonhydrogène est lié de manière covalente au Y66G Ca du cycle cyclisé et est très probablement un atome d’oxygène incorporé par une réaction d’oxydation (voir Fig. 4, qui est publié comme information complémentaire sur le site Web des PNAS, pour le mécanisme proposé). Nous avons confirmé que les pics supplémentaires dans nos cartes omit étaient réels et non dérivés de la variante protéique en reséquençant le plasmide, en purifiant un deuxième lot de protéines, en résolvant une deuxième structure de 2,00 Å et en observant les mêmes pics dans de nouvelles cartes omit. La densité électronique (Fig., 1d) est compatible avec un système de cycle non aromatique à cinq électrons π qui contient un atome de carbone carbonyle tétraédrique S65G (plissant le cycle cyclisé), un tautomère énol pour le carbonyle Y66G et un tautomère céto pour l’atome d’oxygène nouvellement incorporé (Fig. 1f). La cyclisation de Gly-Gly-Gly, qui ne contient pas d’atomes de chaîne latérale, s’oppose au modèle proposé dans lequel l’oxydation de la chaîne latérale précède la cyclisation (22).
Nous avons préparé et cristallisé la variante S65G Y66G dans des conditions anaérobies pour explorer l’incorporation inattendue d’oxygène à Y66G Ca., Étonnamment, la structure anaérobie à une résolution de 1,80 Å (tableau 1) a révélé des résidus de chromophores non cycliques (Fig. 1g). En dehors du chromophore, les structures de précyclisation et de postcyclisation Gly-Gly-Gly sont remarquables similaires (Fig. 2d) et partager avec WT GFP la même liaison hydrogène limitée (6 des 24 interactions possibles chaîne principale) pour l’hélice centrale (Fig. 2e). Ainsi, même la flexibilité supplémentaire de l’épine dorsale conférée par la substitution de Gly pour les acides aminés chromophores n’entraîne pas la formation de liaisons hydrogène supplémentaires de la chaîne principale., L’absence de liaisons hydrogène de la chaîne principale pour les résidus chromophores contribue aux barrières énergétiques d’interconversion apparentes faibles et aux grands réarrangements locaux pour la cyclisation observés dans les structures R96A (ci-dessus). Les distorsions dans l’état de précyclisation sont maintenues dans l’état de postcyclisation, plutôt que soulagées par la formation de chromophores. Ceci argumente contre l’hypothèse de compression mécanique, mais souligne l’importance de l’architecture GFP dans la création d’une conformation spécifique qui favorise la cyclisation peptidique.,
Les résultats structuraux Gly-Gly-Gly révèlent des caractéristiques conformationnelles et énergétiques essentielles à la cyclisation peptidique. Les conformations standard de la chaîne principale pour G67 dans les états de précyclisation (Φ = -90°, Ψ = -16°) et de postcyclisation (Φ = -90°, Ψ = -35°) suggèrent que l’exigence apparente pour G67 dans la formation de chromophores (4) résulte de restrictions stériques plutôt que conformationnelles. En fait, une chaîne latérale Ala modélisée pour le résidu 67 a des collisions significatives de van der Waals avec l’oxygène carbonyle T63., Plus important encore, l’échec de la séquence Gly-Gly-Gly à se cycliser anaérobiquement indique que la cyclisation chez ce mutant est couplée à l’oxydation. L’absence d’occupation partielle d’un produit cyclisé dans des conditions anaérobies suggère que la structure de précyclisation est thermodynamiquement plus stable qu’un état cyclisé mais non encore oxydé., Ainsi, l’oxydation sert à augmenter la conjugaison électronique de la variante Gly-Gly-Gly et piège un produit de cyclisation thermodynamiquement défavorable selon le principe de Le Chatelier comme une espèce non aromatique stabilisée par résonance, à cinq électrons π.