Tulokset
Rakenteiden R96A GFPsol Variantti Ennen ja Jälkeen Peptidi Cyclization. Koska R96 on ehdotettu joko aktivoida S65 karbonyyli varten nukleofiiliset hyökkäys (20) tai suoraan deprotonate, että G67 selkäranka amidi (22), olemme rakentaneet R96A variantti ja huomasi, että tämä kohta mutaatio hidastaa cyclization reaktio minuuteista kuukautta., Puhdistuksen jälkeen aluksi väritön R96A proteiinia, kromofori kypsymisen oli saavuttaa inkubointi 3 kuukauden ajan 37°C. Meidän 1.50-Å resoluution kidehilarakenteen tämän kypsynyt R96A proteiinia (Taulukko 1) on hyvin samanlainen, että sen liukoisuus-optimoitu GFPsol vanhempi, yleinen Ca rms-poikkeama 0,20 Å. GFP: ssä R96 muodostaa vetysidoksen kypsän kromoforeen imidatsolonihapen kanssa. Vuonna R96A mutantti, kolme vesimolekyylit täyttää äänenvoimakkuutta normaalisti käytössä R96 puolella ketju, mutta eivät kykene muodostamaan vetysidoksia kanssa imidazolone happea., Tämä saattaa selittää muutoksia fluoresenssi maxima varten R96A variant (468 nm magnetointi, 503-nm-päästöjen) verrattuna GFPsol (489 nm magnetointi, 508-nm-päästöjen), mikä viittaa siihen, että R96 alentaa innostunut valtion energia kromofori, sopusoinnussa julkaisemattomia tuloksia R96C variant (4). Tärkeää on, että r96a-muunnoksen kromofori on täysin kypsynyt(Kuva. 1a), joka osoittaa, että tämä mutantti säilyttää kaikki kromoforimuodostuksen kannalta välttämättömät komponentit.
Posttranslational muutoksia paljasti rakenteita GFP vaihtoehdot ennen ja jälkeen selkäranka cyclization. Jättää |Fo – Fc| electron tiheys kartat kromofori jäämiä muotoiltu 3 σ (musta). a) 1,50-Å: n syklinen R96A-rakenne. b) 2,00-Å precyclization R96A intermediate a-rakenne. (c) 2,00-Å precyclization R96A intermediate B-rakenne. (D ja e) ortogonaaliset näkymät 1,80-Å Gly-Gly-Gly aerobinen hapetettu postcyclization rakenne. (f) ehdotettu molekyylirakenne Gly-Gly-syklinen rengas. (g) 1,80-Å Gly-Gly-Gly anaerobinen precyclization rakenne., Kaikki on kuvitettu inraster 3d (44).
- Näkymä-inline
- Näytä ponnahdusikkuna
– Olemme käyttäneet hidas kypsymisen määrä R96A variantti eristää GFP välituotteiden ennen cyclization ja siten määrittää kaksi toisistaan riippumatonta kiteisiä rakenteita (Taulukko 1) GFP ennen posttranslational muutoksia (Kuva. 1 B ja c)., Mekaaninen puristus hypoteesi, steric vuorovaikutus tuottama GFP-arkkitehtuuri ehdotetaan nostaa energian precyclization valtion yläpuolella cyclized väli-ja rentouttava tämän kireät lihakkuus asemat kromoforin muodostuminen. Niinpä tutkimme 2.0-Å resoluution R96A precyclization rakenteet todisteita steric vuorovaikutusta, joka voi olla rento, kun kromoforin muodostuminen. Sen sijaan, elektroni tiheys paljastaa suotuisa kyllä tiesin, että kromofori jäämät, joilla ei ole merkittäviä van der Waalsin törmäykset., Kromoforijäämien ulkopuolella nämä kaksi rakennetta ovat hyvin samankaltaisia (viikuna. 2 a). Ca-atomit päällekkäin RMS-poikkeaman kanssa 0,28 Å, ja sivuketjun konformaatiorakenteen uudelleenjärjestelyt ovat vähäisiä. Mielenkiintoista, nämä itsenäisesti määrittää rakenteiden näyttely eri Y66 puolella-ketju conformations, makaa kummallakin puolella neljäs β-säie (Fig. 1 B ja c). Jokainen pinot Q94 ja vie osa ontelon luotu lyhennetty R96. Näiden erilaisten precyclization-välirakenteiden määrittämiseen käytetyt kiteet kasvoivat samoissa olosuhteissa., Näin ollen ehdotamme, että proteiini on isoenergetic valtioiden Y66, joilla on alhainen toisikseen energian esteitä ja että hienovarainen crystal pakkaus erot voivat levittää proteiinin core valita havaittu conformations.
arkkitehtoniset vääristymät ja rakennevertailut precyklizationin ja postcyklizationin osavaltioiden välillä. (a) Päällekkäisyys R96A rakenteita, korostaen suuri conformational muuttaa Y66, mutta muuten pieni Ca eroja precyclization (A keltainen, B, blue) ja postcyclization (vihreä) toteaa., (b) Keski-helix kolme R96A rakenteet näkyvät pinnan kanssa R96A kypsä rakenne, korostaen kierteiset mutka. (c) Rakenteelliset päällekkäin R96A precyclization välituotteiden A (keltainen) ja B (sininen) kanssa kypsä R96A (vihreä) rakenne, osoittaa isoa-ketjun liikkeet muodostavat kromofori. Mallinnettu R96 (violetti) osoittaa, steric vuorovaikutus Y66 puoli-ketjun asema precyclization väli-rakenne., (d) Päällekkäisyys Gly-Gly-Gly-rakenteet ennen (sininen, anaerobinen) ja sen jälkeen (vihreä, aerobinen) peptidi cyclization osoittaa, toiminnallinen ryhmä vuorovaikutusta R96, E222, ja T62 karbonyyli hapen atomien ja kromofori jäämiä. (e) Kaavio vääristymiä main-ketju vety-liimaus vuorovaikutus WT, Gly-Gly-Gly precyclization, ja postcyclization rakenteet (Vasemmalla) näkyy verrattuna kanoninen α-helix (Oikealla). Kiinteät linjat pääketjuatomien välillä osoittavat, että niissä on vetysidos. a–d on kuvitettu avs (45).,
Vertailuja precyclization ja kypsä kromofori valtioiden R96A rakenteita tunnistaa sekä globaalit ja paikalliset ominaisuudet, jotka ajaa peptidi cyclization. Huolimatta dramaattinen liikkeet kromofori-muodostaen jäämiä, jossa Y66 fenoliset happi atomi liikkuu 14 Å ja selkäranka atomien muutos 2.6–3.1 Å, jäämiä ulkopuolella kromofori päällekkäin hyvin kolme R96A rakenteita (Kuva. 2 a). Kromoforiin ankkuroituvat sekä vierekkäiset hydrofobiset jäämät että hydrofobiset vuorovaikutukset Keskisen vääristyneen helixin (viikuna. 2 B)., Sekvenssin linjaus 48 GFP homologeista, jotka kiehuvat (Taulukko 2, joka on julkaistu tukevaa tietoa PNAS web-sivuston, www.pnas.org), jäännös 64, joka välittömästi edeltää kromofori, on pääosin hydrofobisia (41 sekvenssit; F, L, V) tai kysteiini (6 sekvenssit) jäämiä. Mielenkiintoista, kaikki sekvenssit, jotka sisältävät C64 sisältävät myös C29. Kartoitus nämä kysteiini jäämien päälle GFP rakenne (tiedot eivät ole näkyvissä) asettaa heidät järkevä suunta muodostaa disulfidi joukkovelkakirjojen ja tarjota vaihtoehtoinen ankkurointi menetelmää (hydrofobinen vuorovaikutus)., Lisäksi, vaikka oikeakätinen kierukka conformations vuonna Ramachandran juoni, jäämiä tämä vääristynyt ”helix” kypsä GFP tehdä vain kolme-ketju vetysidokset välillä jäännös paria L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), ja V68-F71 (310-helix). R96a-preklitsaatiorakenteisiin lisätään T62-Y66 (α-helix) ja s65t-V68 (310-helix) vetysidokset. Näin, useimmat vääristymät keski-helix eivät ole seurausta kromofori muodostumista, vaan ovat asettaneet proteiini tukirakenteen., Kaikki rakenteet, GFP (1, 17) ja sen punainen fluoresoiva proteiini homologeista, jotka kiehuvat (35, 36) dramaattinen ≈80° mutka helix (Fig. 2B), joka syntyy proteiiniarkkitehtuurista, keskittyy kromoforiin (Kuva. 2 C). Vaikea mutka altistaa T62 ja Y66 karbonyyli happiatomia yhteisvaikutukset kanssa R96 (ks. alla) ja pakottaa G67 typen nucleophile ja S65T karbonyyli happea tiiviimpää yhteyttä (3.0 ja 3.2 Å kaksi precyclization rakenteet) kuin summa (3.25 Å) heidän van der Waals säteiden (37), valmisteltaessa kovalenttisen sidoksen muodostumisen aikana peptidi cyclization (Fig. 2 C)., Merkittävästi, nämä vääristymät poistaa mahdolliset kierteiset vetysidokset, jotka pitäisi muutoin olla rikki energinen kustannus aikana cyclization. Yhdessä, R96A rakenteet viittaavat siihen, että GFP-arkkitehtuuri valvoo epävakautta vääristyminen, että se on esteenä vakaan α-kierteisen konformaation ja luoda valtion lähemmäksi siirtyminen valtion peptidi cyclization., Tämä on analoginen entatic valtion ehdotus metalloproteins (38), jossa proteiinin teline rajoittaa metalli center horjutti geometrinen rakenne alentaa uudelleenjärjestely energian esteitä ja lisätä reaktio hinnat.
S65g Y66G-muunnoksen rakenteet aerobisissa ja anaerobisissa olosuhteissa. Tutkia, onko side-ketju vuorovaikutuksesta kromofori jäämät ovat kriittisiä selkäranka cyclization, meidän rakennettu ja tunnettu väritön S65G Y66G variant (järjestyksessä Gly-Gly-Gly varten kromofori jäämiä)., Mutaation tulokset ovat osoittaneet, että lähes kaikki korvaamista S65, aromaattinen vaihtoja Y66, ja WT G67 muodossa kypsä kromoforeja (4). Kuitenkin, jos mekaaninen puristus malli peptidi cyclization (20) tai ehdotus, että puoli-ketju hapettumista tarvitaan ennen cyclization (22) olivat oikeita, katkaisu to Gly-Gly-Gly-variantti olisi haittaa tai estä selkäranka cyclization. Merkillepantavaa on, että tämän variantin 1,80 Å: n resoluutiorakenteen elektronitiheys (Taulukko 1) paljastaa, että selkäranka on syklinen., Simuloitu hehkutus jättää kartat tälle sykliselle Gly-Gly-muunnokselle(Kuva. 1 d ja e) osoittavat, että imidazolone rengas on siirtynyt ≈0.7 Å sen asema GFPsol rakenne ja muutettu kaksi nonhydrogen atomeja. Ensimmäinen atomi, s65g karbonyylihappi, ei ole kadonnut vetenä, kuten WT GFP: n tapauksessa. Sen sijaan tämä happi pysyy kiinni imidatsolonirenkaassa ja muodostaa vetysidoksen e222: n sivuketjuun (Kuva. 2D)., Toinen nonhydrogen atom on kovalenttisesti sidottu Y66G Ca§: n cyclized rengas ja on todennäköisesti happiatomiin sisällytetty kautta hapettumis-reaktio (ks. 4, joka on julkaistu PNAS – verkkosivuston tukena ehdotetun mekanismin osalta). Olemme vahvistaneet, että ylimääräistä huiput meidän jättää kartat olivat todellisia ja ole johdettu proteiini variantti, jonka uudelleensekvensointipuskuriin plasmidissa, puhdistava toisen erän proteiinia, ratkaista toisen 2.00-Å rakenne, ja havainnoimalla samaa huiput new jättää karttoja. Elektronitiheys (Kuva., 1d) on yhdenmukainen sen kanssa, että viisi-π-elektroni, ei-aromaattisista rengas-järjestelmä, joka sisältää tetraedri S65G karbonyyli hiiliatomin (puckering, että cyclized rengas), on enoli tautomer varten Y66G karbonyyli, ja keto tautomer hiljattain sisällytetty happi-atomi (Fig. 1 F). Cyclization Gly-Gly-Gly, joka ei sisällä puoli-ketjun atomien, väittää vastaan, että ehdotettu malli, jossa puoli-ketju hapettumista edeltää cyclization (22).
Olemme valmiita ja kiteytynyt S65G Y66G variantti anaerobisissa olosuhteissa tutkia odottamaton sisällyttäminen happea Y66G Ca., Yllättäen anaerobinen rakenne 1,80-Å: n resoluutiolla (Taulukko 1) paljasti sekoittamattomia kromoforijäämiä (Kuva. 1g). Kromoforeen ulkopuolella preklitsaatio ja postcyklization Gly-Gly-Gly-rakenteet ovat huomattavan samanlaisia (Kuva. 2d) ja jaa WT GFP: n kanssa sama rajoitettu vetysidos (6 / 24 mahdollisesta pääketjun vuorovaikutuksesta) Keski-helixin (Kuva. 2 e). Siten jopa lisätä selkärangan joustavuuden tuottamat korvaaminen Gly varten kromofori aminohappoja ei johda muodostumista ylimääräisiä main-ketju vetysidokset., Puute main-ketju vety joukkovelkakirjoja kromofori jäämiä edistää ilmeisen vähäinen toisikseen energian esteitä ja suuri paikallinen uudelleenjärjestelyjä varten cyclization havaittu R96A rakenteet (yllä). Vääristymiä precyclization valtion ylläpidetään postcyclization valtion, pikemminkin kuin helpottunut kromoforin muodostuminen. Tämä väittää vastaan mekaaninen puristus hypoteesi, mutta korostaa, että on tärkeää, että GFP-arkkitehtuuri luoda erityinen rakenne, joka suosii peptidi cyclization.,
Gly-Gly-Gly-rakenteellisen tulokset osoittavat, conformational ja energinen ominaisuudet kriittinen peptidi cyclization. Standardin tärkein-ketju conformations varten G67 sekä precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) ja postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) todetaan, viittaa siihen, että näennäinen vaatimus G67 vuonna kromoforin muodostuminen (4) tulokset steric sijaan, että minussa ei ole rajoituksia. Itse asiassa, on mallinnettu Ala puolella ketjun jäännös 67 on huomattava van der Waalsin yhteentörmäykset T63 karbonyyli happea., Vielä tärkeämpää on, epäonnistuminen Gly-Gly-Gly järjestyksessä cyclize anaerobisesti osoittaa, että cyclization tämä mutantti on kytketty hapettumista. Puuttuminen osittainen täyttöaste cyclized tuotteen anaerobisissa olosuhteissa viittaa siihen, että precyclization rakenne on termodynaamisesti stabiilimpi kuin a cyclized mutta ei ole vielä hapettunut valtion., Näin ollen hapetus pyritään lisäämään sähköisten konjugaatio Gly-Gly-Gly-variantti ja ansa on termodynaamisesti epäsuotuisa cyclization tuotteen mukaan Le Chatelier n periaate kuin resonanssi-vakiintunut, viisi-π-elektroni, ei-aromaattisista lajeja.