Výsledky
Konstrukce R96A GFPsol Varianta Před a Po Peptid Cyclization. Protože R96 bylo navrženo, aby buď aktivovat S65 karbonylové pro nucleophilic útok (20) nebo přímo deprotonate na G67 páteř amid (22), kterou jsme postavili na R96A varianta a zjistil, že tento bod mutace zpomaluje cyclization reakce od minut po měsíce., Po očištění původně bezbarvý R96A bílkovin, chromofor zrání bylo dosaženo inkubací po dobu 3 měsíců při teplotě 37°C. Naše 1.50-Å řešení krystalografické struktury tohoto vyzrálého R96A bílkovin (Tabulka 1) je velmi podobný jeho rozpustnost-optimalizované GFPsol rodič, s celkovou Ca rms odchylka 0,20 Å. V GFP tvoří R96 vodíkovou vazbu s imidazolonovým kyslíkem zralého chromoforu. V mutantu R96A vyplňují tři molekuly vody objem normálně obsazený postranním řetězcem R96, ale nevytvářejí vodíkové vazby s kyslíkem imidazolonu., To může vysvětlit posuny v fluorescenční maxima pro R96A varianta (468 nm excitace, 503 nm emise) ve srovnání s GFPsol (489 nm excitace, 508 nm emise), což naznačuje, že R96 snižuje excitovaného stavu energie chromofor, v souladu s nepublikované výsledky na R96C varianta (4). Důležité je, že chromofor varianty R96A je plně vyzrálý (obr. 1a), což dokazuje, že tento mutant si zachovává všechny složky nezbytné pro tvorbu chromoforu.
posttranslační modifikace odhalené strukturami variant GFP před a po cyklizaci páteře. Vynechat| Fo – Fc / elektronové mapy hustoty pro chromoforové zbytky tvarované při 3 σ (černé). a) 1,50-Å cyklizovaná struktura R96A. b) 2,00-Å precyclization R96A intermediate a struktura. c) 2.00-Å precyclization r96a intermediate B struktura. (D a e) ortogonální pohledy na 1.80-Å Gly-Gly-Gly aerobní oxidované postcyklizační struktury. f) navrhovaná molekulární struktura Cyklizovaného kruhu Gly-Gly-Gly. g) anaerobní precyklizační Struktura 1, 80-Å Gly-Gly-Gly., Všechny jsou ilustrovány inraster 3d (44).
- Zobrazit inline
- Zobrazit popup
Jsme použili pomalé zrání sazba R96A varianta izolovat ONZP meziprodukty před cyclization a tím určit dva nezávislé krystalografické struktury (Tabulka 1) ONZP před posttranslační modifikace (Obr. 1 b A c)., V mechanické komprese hypotéza, stérické interakce generované ONZP architektury jsou navrženy pro zvýšení energie precyclization stát nad tím cyklizovaného střední a relaxační této napjaté konformaci disky chromofor formace. Zkoumali jsme tedy precyklizační struktury rozlišení 2.0-Å r96a pro důkaz sterických interakcí, které by mohly být uvolněny při tvorbě chromoforu. Místo toho elektronová hustota odhaluje příznivé konformace pro chromoforové zbytky bez významných van der Waalsových kolizí., Mimo zbytky chromoforu jsou obě struktury velmi podobné (obr. 2a). Atomy Ca se překrývají s odchylkou rms 0,28 Å a konformační uspořádání postranního řetězce jsou menší. Je zajímavé, že tyto nezávisle struktury vykazují výraznou Y66 straně-konformací řetězce, ležící na obou stranách čtvrté β-vlákna (Obr. 1 b A c). Každý stohy s Q94 a zabírá část dutiny vytvořené zkrácením R96. Krystaly použité k určení těchto různých precyklizačních mezilehlých struktur rostly za stejných podmínek., Proto navrhujeme, že protein má isoenergetic státy pro Y66 s nízkými interconversion energetické bariéry a jemné crystal balení rozdíly mohou šířit na proteinové jádro vyberte pozorovány konformací.
architektonické zkreslení a strukturální srovnání mezi precyklizačním a postcyklizačním stavem. a) superpozice struktur R96A, zdůrazňující velké konformační změny pro Y66, ale jinak malé rozdíly Ca mezi precyklizací (a ve žluté, B v modré) a postcyklizačními (zelenými) stavy., b) Střední šroubovice pro tři konstrukce R96A zobrazené s povrchem zralé konstrukce R96A, zdůrazňující spirálový ohyb. (c) Strukturální překrytí R96A precyclization meziproduktů A (žlutá) a B (modrá) s zralé R96A (zelená) strukturu, ukazuje velké hlavní řetězce pohybů, které tvoří chromofor. Modelovaný R96 (fialový) označuje sterické interakce s polohou postranního řetězce Y66 precyklizační mezilehlé struktury., (d) Superpozice Gly-Gly-Gly struktur před (modrá, anaerobní) a po (zelená, aerobní) peptid cyclization ukazuje funkční skupiny interakce mezi R96, E222, a T62 karbonylových atomů kyslíku a chromofor zbytků. e) schéma zkreslení interakcí vodíku s hlavním řetězcem pro precyklizaci WT, Gly-Gly-Gly a postcyklizační struktury (vlevo) zobrazené ve srovnání s kanonickou α-helix (vpravo). Pevné linie mezi atomy hlavního řetězce naznačují přítomnost vodíkové vazby. a-d jsou ilustrovány pomocí avs (45).,
Srovnání precyclization a zralé chromofor státy pro R96A struktur identifikovat lokální i globální funkce, které drive peptid cyclization. I přes dramatické pohyby chromoforem-tvořící rezidua, v nichž Y66 fenolické atom kyslíku se pohybuje 14 Å a páteř atomy posun 2.6–3.1 Å, zbytky mimo chromofor překrýt dobře pro tři R96A struktur (Obr. 2a). Chromofor je ukotven jak sousedními hydrofobními zbytky, tak hydrofobními interakcemi na koncích centrální zkreslené šroubovice (obr. 2b)., V sequence alignment 48 ONZP homologů (Tabulka 2, která je zveřejněna jako podpůrné informace o PNAS webové stránky, www.pnas.org), zbytky 64, který bezprostředně předchází chromofor, je v podstatě hydrofobní (41 sekvencí; F, L, V) nebo cystein (6 sekvencí) reziduí. Zajímavé je, že všechny sekvence, které obsahují C64, obsahují také C29. Mapování těchto zbytky cysteinu na ONZP strukturu (údaje nejsou uvedeny) místa je v přiměřené orientace tvořit disulfidové vazby a poskytnout alternativní způsob kotvení (hydrofobní interakce)., Navíc, i přes pravák helikální konformace v Ramachandran plot, zbytky této zkreslené, „helix“ v zralé ONZP se pouze tři hlavní řetězce vodíkové vazby, mezi zbytky páry L60-L64 (α-helix), V61-S65T (α-helix), a V68-F71 (310-helix). Precyklizační struktury R96A přidávají vodíkové vazby T62-Y66 (α-helix) a s65t-V68 (310-helix). Většina deformací v centrální šroubovice tedy není důsledkem tvorby chromoforu, ale spíše je uložena proteinovým lešením., Ve všech strukturách GFP (1, 17) a jeho červených fluorescenčních proteinových homologů (35, 36) dramatický ohyb ≈80° ve spirále (obr. 2b), generovaný proteinovou architekturou, je zaměřen na chromofor (obr. 2c). Těžké ohnout vystavuje T62 a Y66 karbonylových atomů kyslíku pro interakce s R96 (viz níže) a nutí G67 dusíkatých nukleofil a S65T karbonylové kyslíku do užšího kontaktu (3.0 a 3.2 Å ve dvou precyclization struktury), než je součet (3.25 Å), jejich van der Waalsových poloměrů (37), příprava pro kovalentní vazbu při tvorbě peptidové cyclization (Obr. 2c)., Tato zkreslení významně eliminují potenciální spirálové vodíkové vazby, které by jinak musely být během cyklizace přerušeny za energetické náklady. Spolu, R96A struktur naznačují, že GFP architektury prosazuje destabilizující deformace, brání stabilní α-helikální konformaci a vytvoření státu, blíže k přechodu státu pro peptid cyclization., To je analogické k entatic státu návrh metalloproteins (38), v kterém protein lešení omezuje kovových center v destabilizovaných geometrické konformaci nižší reorganizaci energetických bariér a zvýšení reakční rychlosti.
struktury varianty S65G Y66G za aerobních a anaerobních podmínek. Zkoumat, zda boční řetězce interakcí chromofor zbytky jsou důležité pro páteř cyclization, jsme konstruovány a vyznačují bezbarvý S65G Y66G varianta (sekvence Gly-Gly-Gly pro chromofor zbytky)., Mutační výsledky prokázaly, že téměř jakákoli náhrada za S65, aromatické substituce pro Y66 a WT G67 tvoří zralé chromofory (4). Nicméně, pokud mechanická komprese model pro peptid cyclization (20) nebo návrh, že boční řetězce oxidaci je nutné před cyclization (22) byly správné, zkrácení na Gly-Gly-Gly varianta by měla bránit nebo znemožňovat páteř cyclization. Je pozoruhodné, že hustota elektronů pro strukturu rozlišení 1, 80 Å této varianty (Tabulka 1) ukazuje, že páteř je cyklizován., Simulované žíhání vynechává mapy pro tuto cyklizovanou variantu Gly-Gly-Gly (obr. 1 D a e) ukazují, že imidazolonový kruh je posunut ≈0,7 Å ze své polohy ve struktuře GFPsol a modifikován dvěma atomy nehydrogenu. První atom, karbonylový kyslík s65g, nebyl ztracen jako voda, jako je tomu u WT GFP. Místo toho zůstává tento kyslík připojen k imidazolonovému kruhu a vytváří vodíkovou vazbu s bočním řetězcem E222 (obr. 2d)., Druhý atom nonhydrogenu je kovalentně vázán na Y66g Ca cyklizovaného kruhu a je s největší pravděpodobností atomem kyslíku začleněným oxidační reakcí (viz obr. 4, který je publikován jako podpůrné informace na webových stránkách PNAS, pro navrhovaný mechanismus). Potvrdili jsme, že další vrcholy v naší vynechat mapy byly skutečné a nejsou odvozeny od bílkovin varianta tím, resekvencování plasmidu, čištění druhá dávka bílkovin, řešení druhé 2.00-Å strukturu, a pozorování stejné vrcholy v new vynechat mapy. Elektronová hustota (obr., 1d) je v souladu s pěti-π-elektron, nearomatické ring systém, který obsahuje tetraedrické S65G karbonylové skupině atom uhlíku (svraštění na cyklizovaného prsten), enol tautomer pro Y66G karbonylové a keto tautomer pro nově začleněna atom kyslíku (Obr. 1f). Cyklizace Gly-Gly-Gly, která neobsahuje žádné atomy postranního řetězce, argumentuje proti navrhovanému modelu, ve kterém oxidace postranního řetězce předchází cyklizaci (22).
připravili jsme a krystalizovali variantu S65G Y66G za anaerobních podmínek, abychom prozkoumali neočekávané začlenění kyslíku do Y66g Ca., Překvapivě anaerobní struktura při rozlišení 1, 80-Å (Tabulka 1) odhalila necyklizované zbytky chromoforu (obr. 1g). Mimo chromofor jsou pozoruhodné podobné struktury precyklizace a postcyklizace Gly-Gly-Gly (obr. 2D) a sdílet s WT GFP stejné omezené vodíkové spojení (6 z 24 možných interakcí hlavního řetězce) pro centrální šroubovice (obr. 2e). Takže ani přidaná flexibilita páteře, kterou poskytuje náhrada Gly za aminokyseliny chromoforu, nevede k tvorbě dalších vodíkových vazeb s hlavním řetězcem., Nedostatek hlavní řetězce vodíkových vazeb pro chromofor zbytky přispívá ke zdánlivé nízké interconversion energetické bariéry a velké místní přestavby pro cyclization pozorován v R96A struktur (viz výše). Deformace ve stavu precyklizace jsou udržovány ve stavu postcyklizace, spíše než uvolněny tvorbou chromoforu. To argumentuje proti hypotéze mechanické komprese, ale podtrhuje důležitost architektury GFP při vytváření specifické konformace, která podporuje cyklizaci peptidů.,
strukturální výsledky Gly-Gly-Gly odhalují konformační a energetické rysy kritické pro cyklizaci peptidů. Standardní hlavní-konformace řetězce pro G67 v obou precyclization (Φ = -90°, Ψ = -16°) a postcyclization (Φ = -90°, Ψ = -35°) státy, naznačuje, že zdánlivý požadavek na G67 v chromofor formace (4) výsledky z stérické spíše než konformační omezení. Ve skutečnosti modelovaný postranní řetězec Ala pro zbytek 67 má významné srážky van der Waals s karbonylovým kyslíkem T63., Ještě důležitější je, že selhání sekvence Gly-Gly-Gly cyklizovat anaerobně naznačuje, že cyklizace v tomto mutantu je spojena s oxidací. Nedostatek jakékoli částečné obsazení cyklizovaného produkt za anaerobních podmínek naznačuje, že precyclization struktura je termodynamicky stabilnější než cyklizovaného ale ještě není oxiduje státu., Tak, oxidace slouží ke zvýšení elektronické časování Gly-Gly-Gly varianta a past je termodynamicky nepříznivý cyclization produktu podle Le chatelierův princip jako rezonance-stabilizovaný, pět-π-elektron, nearomatické druhů.