Pământul găzduiește milioane de specii bacteriene, fiecare cu caracteristici unice. Identificarea acestor specii este esențială în evaluarea probelor de mediu. De asemenea, medicii trebuie să distingă diferite specii bacteriene pentru a diagnostica pacienții infectați.pentru a identifica bacteriile, pot fi utilizate o varietate de tehnici, inclusiv observarea microscopică a morfologiei sau a creșterii pe un mediu specific pentru a observa morfologia coloniilor., Analiza genetică, o altă tehnică de identificare a bacteriilor a crescut în popularitate în ultimii ani, datorată în parte secvențierii genei ARN ribozomale 16S.ribozomul bacterian este un complex de ARN proteic format din două subunități. Subunitatea 30S, cea mai mică dintre aceste două subunități, conține ARNr 16S, care este codificată de gena ARNr 16S conținută în ADN-ul genomic. Regiunile specifice ale ARNr 16S sunt foarte conservate, datorită funcției lor esențiale în asamblarea ribozomilor. În timp ce alte regiuni, mai puțin critice pentru a funcționa, pot varia între speciile bacteriene., Regiunile variabile din ARNr 16S pot servi ca amprente moleculare unice pentru speciile bacteriene, permițându-ne să distingem tulpini fenotipice identice.
după obținerea unui eșantion de calitate a gDNA, PCR a genei de codificare rRNA 16S poate începe. PCR este o metodă de biologie moleculară frecvent utilizată, constând în cicluri de denaturare a șablonului ADN dublu catenar, recoacerea perechilor de primeri universali, care amplifică regiunile extrem de conservate ale genei și extinderea primerilor prin ADN polimerază., În timp ce unii primeri amplifică cea mai mare parte a genei de codificare rRNA 16S, alții amplifică doar fragmente din ea. După PCR, produsele pot fi analizate prin electroforeză în gel de agaroză. Dacă amplificarea a avut succes, gelul trebuie să conțină o singură bandă de o dimensiune așteptată, în funcție de perechea de primeri utilizată, până la 1500bp, lungimea aproximativă a genei rRNA 16S.
după purificare și secvențiere, secvențele obținute pot fi apoi introduse în baza de date BLAST, unde pot fi comparate cu secvențele rRNA de referință 16S., Deoarece această bază de date returnează potriviri bazate pe cea mai mare similitudine, acest lucru permite confirmarea identității bacteriilor de interes. În acest videoclip, veți observa secvențierea genelor rRNA 16S, inclusiv PCR, analiza și editarea secvenței ADN, asamblarea secvenței și căutarea bazei de date.la manipularea microorganismelor, este esențial să se urmeze bune practici microbiologice, inclusiv utilizarea tehnicii aseptice și purtarea echipamentului individual de protecție adecvat. După efectuarea unei evaluări adecvate a riscurilor pentru microorganismul sau eșantionul de mediu de interes, obțineți o cultură de testare., În acest exemplu, se folosește o cultură pură de Bacillus subtilis.pentru a începe, creșteți microorganismul pe un mediu adecvat în condițiile adecvate. În acest exemplu, Bacillus subtilis 168 este cultivat în bulion LB peste noapte într-un incubator de agitare setat la 200 rpm la 37 grade Celsius. Apoi, utilizați un kit disponibil comercial pentru a izola ADN-ul genomic sau gDNA de la 1, 5 mililitri din cultura peste noapte B. subtilis.pentru a verifica calitatea ADN-ului izolat, mai întâi amestecați cinci microlitri ai gDNA izolată cu un microlitru de colorant de încărcare a gelului ADN. Apoi, încărcați proba pe un 0.,8% gel de agaroză, care conține reactiv de colorare ADN, cum ar fi SYBR safe sau EtBr. După aceasta, încărcați un standard de masă moleculară de o kilobază pe gel și executați electroforeza până când colorantul frontal este la aproximativ 0,5 centimetri de fundul gelului. Odată ce electroforeza în gel este completă, vizualizați gelul pe un transiluminator de lumină albastră. GDNA ar trebui să apară ca o bandă groasă, cu o dimensiune mai mare de 10 kilobase și să aibă o pată minimă.după aceasta, pentru a crea diluții seriale ale gDNA, etichetați trei tuburi microcentrifuge ca 10X, 100x și 1000x., Apoi, utilizați o pipetă pentru a distribui 90 de microlitri de apă distilată sterilă în fiecare dintre tuburi. Apoi, adăugați 10 microlitri de soluție gDNA la tubul 10x. Pipetați întregul volum în sus și în jos pentru a vă asigura că soluția este amestecată bine. Apoi, scoateți 10 microlitri de soluție din tubul 10X și transferați-l în tubul 100x. Se amestecă soluția așa cum s-a descris anterior. În cele din urmă, transferați 10 microlitri de soluție în tubul 100X, în tubul 1000x.pentru a începe protocolul PCR, dezghețați reactivii necesari pe gheață. Apoi, pregătiți amestecul PCR master., Deoarece ADN polimeraza este activă la temperatura camerei, reacția stabilită trebuie să aibă loc pe gheață. Alicota 49 microlitri de amestec master în fiecare dintre tuburile PCR. Apoi, adăugați un microlitru de șablon la fiecare dintre tuburile experimentale și un microlitru de apă sterilă la tubul de control negativ, pipetând în sus și în jos pentru a se amesteca. După aceasta, setați mașina PCR conform programului descris în tabel. Așezați tuburile în termociclator și porniți programul.,după finalizarea programului, examinați calitatea produsului dvs. prin electroforeză în gel de agaroză, așa cum s-a demonstrat anterior. O reacție reușită utilizând protocolul descris ar trebui să producă o singură bandă de aproximativ 1,5 kilobază. În acest exemplu, eșantionul care conține 100x gDNA diluat a produs produsul de cea mai bună calitate. Apoi, purificați cel mai bun produs PCR, în acest caz, gDNA 100x, cu un kit disponibil comercial. Acum, produsul PCR poate fi trimis pentru secvențiere.
în acest exemplu, produsul PCR este secvențiat folosind primeri înainte și invers., Astfel, sunt generate două seturi de date, fiecare conținând o secvență ADN și o cromatogramă ADN: unul pentru primerul înainte și celălalt pentru primerul invers. Mai întâi, examinați cromatogramele generate de fiecare primer. O cromatogramă ideală ar trebui să aibă vârfuri distanțate uniform, cu semnale de fundal puțin sau deloc.
dacă cromatogramele prezintă vârfuri duble, este posibil să fi fost prezente mai multe șabloane ADN în produsele PCR, iar secvența trebuie eliminată. Dacă cromatogramele conțineau vârfuri de culori diferite în aceeași locație, software-ul de secvențiere probabil nucleotide greșite., Această eroare poate fi identificată și corectată manual în fișierul text. Prezența vârfurilor largi în cromatogramă indică o pierdere de rezoluție, ceea ce determină o numărare greșită a nucleotidelor în regiunile asociate. Această eroare este dificil de corectat și neconcordanțele în oricare dintre etapele ulterioare ar trebui tratate ca nesigure. Calitatea slabă a citirii cromatogramei, indicată de prezența mai multor vârfuri, apare de obicei la cele cinci capete prime și trei prime ale secvenței. Unele programe de secvențiere elimină automat aceste secțiuni de calitate scăzută., Dacă secvența dvs. nu a fost trunchiată automat, identificați fragmentele de calitate scăzută și eliminați bazele respective din fișierul text.
utilizați un program de asamblare ADN pentru a asambla cele două secvențe de grund într-o secvență continuă. Rețineți că secvențele obținute folosind grunduri înainte și invers ar trebui să se suprapună parțial. În programul de asamblare ADN, introduceți cele două secvențe în format FASTA în caseta corespunzătoare. Apoi, faceți clic pe butonul Trimiteți și așteptați ca programul să returneze rezultatele.pentru a vizualiza secvența asamblată, faceți clic pe Contigs din fila Rezultate., Apoi, pentru a vizualiza detaliile alinierii, selectați detalii de asamblare. Navigați la site-ul web pentru instrumentul de bază de căutare aliniere locală sau BLAST și selectați instrumentul nucleotide BLAST pentru a compara secvența dvs. cu baza de date. Introduceți secvența dvs. în caseta de text secvență de interogare și selectați baza de date corespunzătoare din meniul derulați în jos. În cele din urmă, faceți clic pe butonul BLAST din partea de jos a paginii și așteptați ca instrumentul să returneze cele mai similare secvențe din Baza de date.
în acest exemplu, cea mai bună lovitură este B., subtilis tulpina 168, care arată 100% identitate cu secvența din Baza de date BLAST. Dacă lovitura de top nu arată identitatea 100% speciei sau tulpinii așteptate, faceți clic pe secvența care se potrivește cel mai bine interogării dvs. pentru a vedea detaliile alinierii. Nucleotidele aliniate vor fi unite prin linii verticale scurte, iar nucleotidele nepotrivite vor avea decalaje între ele. Concentrându-se pe regiunile identificate nepotrivite, revizuiți secvența și repetați căutarea exploziei, dacă doriți.