3.1.2.2. HPLC
HPLC folosind faze mobile pe bază de acetonitril sau hexan permite detectarea directă a fosfolipidelor fără curățarea prealabilă a extractului brut, făcând astfel aceste metode simple și rapide. Cu toate acestea, aceste metode nu separă în mod eficient diferitele fosfolipide inozitol. Nakamura și colab. (1989) au dezvoltat o procedură HPLC care analizează în mod specific PtdIns și PtdInsP2 în creier., În această metodă, extractul lipidic este primul derivat cu 9-anthryldiazomethane de a produce (9-anthryl) PtdInsP și di(9-anthryl) PtdInsP2 și apoi derivat eșantion este separat prin HPLC cu detecție UV la 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn și SM nu sunt derivat cu acest reactiv și, prin urmare, nu interfera cu testul (Yamada et al., 1988). Această metodă este mai sensibilă decât metoda de detectare UV subivatizată pentru analiza fosfolipidelor inozitol.Low (1990) a descris utilizarea coloanelor de celuloză DEAE pentru HPLC preparativ al lipidelor cerebrale., Fosfolipidele cerebrale dizolvate în 50 ml de Solvent A (cloroform/metanol/H2O, 20:9:1, de vol.) și aplicată pe coloana de celuloză (DEAE celuloza, Sigma), care se spală cu alcaline și acid la neutralitate. Celuloza DEAE spălată este ambalată într-o coloană de sticlă (2 cm × 38 cm) cu fitinguri rezistente la solvenți. Coloana este apoi eluată la un debit de 100 ml / h cu 1 1 gradient liniar de la solventul A 100% la solventul B 100% (solventul A conținând acetat de amoniu 0,6 m)și fracțiunile de 13-15 ml sunt colectate și analizate pentru fosfor (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Izolarea Ptdinsp – urilor din creierul bovin printr-o cromatografie pe coloană de DEAE-celuloză. Spălat cu Acid metanol-a precipitat Folch Fracțiune a fost eluat de la un DEAE-celuloză coloană cu un gradient de 100% Solvenți (cloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, în vol.) la 100% Solvent B (Solvent A care conține 0,6 m acetat de amoniu) și fracțiuni de 13-15 ml colectate. Fracțiunile au fost analizate pentru fosfor organic. Recuperarea medie a fosforului organic aplicat a fost de aproximativ 90%., Vârful eluting la numărul de fracțiune. Douăzeci și cinci a fost prezent reproductibil, dar nu a fost identificat. Compoziția vârfurilor a fost determinată prin analiza TLC a fracțiilor grupate. Vârfurile sunt identificate așa cum se arată în figură.
reprodus din Low (1990) cu permisiunea editorului.
alternativ, Low (1990) a efectuat etapa cromatografică prin HPLC preparativ folosind o coloană amino. Fosfolipidele cerebrale au fost dizolvate în 5 ml de Solvent A și au fost aplicate la un debit de 2.,5 ml/min la 10 mm × 250 mm amino-NP coloana (5 µm sferice de siliciu cu n-propylamine mortala faza, IBM Instrumente, Danbury, CT) cu un 4.5 mm × 50 mm coloană de gardă echilibrat cu Solvent A. coloana este eluat cu un debit de 2,5 ml/min, cu 25 ml de Solvent-O, 125 ml gradient de 100% Solvent la 100% Solvent B, și 100 ml de 100% Solvent B; 5 ml fracții colectate. Fracțiunile cumulate sunt concentrate prin ajustarea la 18 ml cu solventul A și fosfolipidele extrase. Recuperarea medie a fosforului organic este de 80%., O separare completă a PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) și PtdInsP2 (160-200 ml) a fost obținut (cromatograma nu sunt prezentate). PtdIns, cu toate acestea, se suprapune cu PtdSer. Compoziția vârfurilor a fost determinată cu TLC de fracții grupate.
Low (1990)a descris, de asemenea, o purificare HPLC a Ptdinelor marcate(4)P și Ptdinelor(4,5) P2 din trombocitele umane. Extractul lipidic din trombocite a fost preparat din 60 ml de sânge uman proaspăt în prezența metanolului precipitat PtdInsPs creier bovin ca purtător, este în cele din urmă redizolvat în 0.,5 1 de Solvent-O și aplicat la un debit de 1 ml/min pentru un avans de 4,5 mm × 250 mm amino-NP coloana echilibrat în Solvent A. coloana este eluat cu 5 ml de Solvent a (25 ml gradient liniar de la 100% Solvent la 100% Solvent B), și 20 ml de Solvent B. Un mililitru fracțiuni sunt colectate și radioactivitatea determinată de lichid de scintilație. Recuperarea medie a radioactivității Aplicate este de aproximativ 70%. Există o rezoluție excelentă a celor trei fosfatide inozitol, dar Ptdinele se suprapun cu PtdOH., Prin urmare, această procedură HPLC nu este adecvată pentru prepararea Ptdinelor, deoarece PtdOH, care în majoritatea tipurilor de celule este etichetat mai rapid de Pi, nu este rezolvat din aceasta. Este posibil ca și alte fosfolipide anionice, cum ar fi PtdSer va fi prost rezolvate de PtdIns de amino-NP coloana, cum s-a observat cu DEAE-celuloză procedura.după cum sa discutat mai sus, niciuna dintre metodele de mai sus nu este eficientă în separarea Ptdinsp-urilor individuale în formă pură de extractele de țesut brut. Prin urmare, extractele lipidice trebuie prelucrate prin mai multe etape cromatografice., În acest scop, extractul este supus mai întâi cromatografiei Sephadex pentru separarea lipidelor de nonlipidele din extract. Fracția lipidică este apoi turnată pe o coloană DEAE care este eluată cu diferiți solvenți. Ptdinsp – urile sunt recuperate prin eluție cu cloroform/metanol/sare de amoniu ca etapă finală de eluție. Fracțiunile individuale sunt concentrate la 100 µl la 45°C sub azot și apoi reziduul concentrat este separat în continuare prin cromatografie cartuș-coloană, TLC, HPLC sau alte proceduri cromatografice.,
Singh (1992) a descris de extracție și analiză a PtdIns, PtdIns(4)P și PtdIns(4,5)P2 folosind un Sep-Pak cartuș. Un extract total de lipide (Folch și colab., 1957) a sinaptozomilor și microvaselor creierului de șobolan a fost preparat pentru prima dată și prima fracție generată (fracția 1) a fost colectată și extrasă în continuare pentru a separa fosfolipidele și glicolipidele, așa cum este descris de Dugan et al. (1986). Fracția fosfolipidă a fost supusă cromatografiei DEAE-celuloză (secvența de separare 4) așa cum este descrisă de Rouser et al. (1969) pentru a purifica în continuare lipidele inozitol., Extractul purificat a fost transferat într-un cartuș Sep-Pak. Diferite lipide de inozitol sunt eluate din coloană cu un gradient liniar de acetat de amoniu și apă de la 0,5% acetat de amoniu (200 mM) și 99,5% apă la 75% acetat de amoniu și 25% apă în 60 min la un debit de 0,5 ml/min (a se vedea capitolul 2). Eluatul coloanei timp de 120 min a fost colectat în fracțiuni de 1 ml. Vârfuri diferite au fost identificate prin utilizarea PtdIns, PtdIns(4)P și PtdIns(4,5)P2 vârfuri ca puncte de referință., Fracțiunile care conțin lipide individuale de inozitol au fost grupate și analizate de HPLC așa cum este descris de Geurts van Kessel et al. (1977). Fosfolipidele individuale au fost detectate la 206 nm folosind un detector de matrice de diode programat să scaneze un interval de 200-350 nm. Singh (1992) a demonstrat recuperarea 50-90% a PtdIns și InsPs din probele cerebrale. InsP3 și InsP4 expuse cele mai mici de recuperare din cauza săraci cuantificare, mai degrabă decât un biet metoda de extracție. Cartușul metode nu au fost aplicate pentru izolarea PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 și PtdIns (3,4,5)P3.Cronholm și colab., (1992) au descris izolarea PtdInsPs din pancreasul de șobolan. Fiecare pancreasului a fost imediat omogenizat în 3 ml de cloroform/metanol (1:2, v/v), și de aproximativ 3 MBq de 3H-etichetate PtdIns(4)P sau PtdIns(4,5)P2-au adăugat, împreună cu 0,6 ml de 1.2 aq. HCl înainte de extracție cu cloroform, așa cum este descris de Schacht (1981). Metanolul a fost adăugat la extractele adunate și spălate pentru a obține cloroform / metanol (3: 2, v/v). Soluția a fost aplicată pe coloana Lipidex-DEAE, iar majoritatea lipidelor au fost eluate cu cloroform/metanol (3:2, v/v) sau cloroform/metanol/apă (3:6:1 pe vol.)., PtdIns și PtdSer au fost eluate împreună cu 0,03 m H3PO4 și material neidentificat cu 0,1 m H3PO4. Ptdinele(4)P au fost eluate cu 0,25 m H3PO4 și Ptdinele (4,5) P2 cu 0,5 m H3PO4, după cum indică radioactivitatea eluată. Toate fracțiunile au fost extrase cu 0,4 ml de apă/ml eluat. Faza superioară a fost extrasă înapoi cu 0.1 vol. de cloroform. Fazele cloroform grupate au fost spălate cu 0,4 vol. de 0,5 m HCl în 50% aq. metanol. Fracțiunile au fost utilizate pentru determinarea speciilor moleculare de către FAB/MS (vezi mai jos).
Gunnarsson și colab., (1997) a folosit HPLC de fază normală cu detectarea dispersiei luminii prin evaporare pentru analiza probelor comerciale de PtdInsPs împreună cu alte fosfolipide. Folosind un gradient liniar de A, cloroform / metanol / amoniac (50: 45: 3, de vol.) și B, cloroform / metanol / apă / amoniac (25: 55: 17: 3, de vol.) se obțin vârfuri bine rezolvate pentru PtdIns (4)P și PtdIns(4,5) P2. Curbele de răspuns la doză pentru PTDIN (4) P și PTDIN (4,5) P2 nu au fost liniare, ceea ce este o caracteristică a detectorului de împrăștiere a luminii (rezultatele nu sunt prezentate)., În majoritatea scopurilor, tehnica HPLC este superioară în rezoluție, viteză și confort general față de procedura DEAE-celuloză și este metoda de alegere dacă echipamentul HPLC este disponibil. DEAE-celuloza este ieftină și purificarea pe scară largă ar putea necesita utilizarea acestui material. Procedura HPLC este, de asemenea, superioară unora sau în toate privințele procedurilor alternative de purificare a polifosfoinozitidelor, de exemplu TLC preparativ sau cromatografia de afinitate a neomicinei.