Figura 1. Selectate trei imagini dintr-un film de POLO depleție de celule arată în mod clar că, de-a lungul timpului, intens centromerului/kinetochore semnal (rosu) rezolvă într-o pereche de puncte, ceea ce demonstrează că cromozomii sunt syntelically atașat la ax microtubuli (verde). Seturile de date pentru microscopie fluorescentă 4D au fost colectate la fiecare 30 de secunde cu 0.,5 mm, z-pașii care acoperă întregul volum a celulelor, folosind o temperatură de 100°, 1.4 NA plan este mult mai avansata obiectiv la 25°C cu Andor Revoluția discul confocal unitate și iXon EMCCD camera, ambele conduse de Andor IQ-ul live-mobil software-ul de imagini.diviziunea celulară mitotică se bazează pe capacitatea celulelor de a distribui corect cromatidele surori în celulele Formatoare. Pentru a efectua în mod fiabil celulele funcționale utilizează mecanisme de editare interne pentru a corecta atașamentele inexacte ale fibrelor cromozomiale / axului., Asociat kinetochores sunt de obicei aliniate pentru a atașa în mod corespunzător ax fibre și de a separa cromatinei, cu toate acestea, eronate și nealiniate kinetochores faci rezultat. Celulele conțin mecanisme de editare specializate pentru a preveni și corecta aceste perechi kinetochore nealiniate, deși mecanismul exact nu este bine înțeles 1,2 ., Este postulat de către Tatiana Moutinho-Santos de la Universidade do Porto, Portugalia Instituto de Biologia Moleculară e Celular (IBMC) că prezența POLO kinaza este necesar să se promoveze cromozom bi-orientare (numit amphitelic aranjament) și, prin urmare, menținerea corectă kinetochore aliniere.

Pentru a înțelege mai bine rolul său în reglementarea kinetochore dezvoltare, Dr. Moutinho dos Santos studiat epuizate Drosophila POLO kinazei în celule vii pentru a susține POLO implicarea în funcții de editare necesare pentru a menține amphitelic kinetochore aranjament., În acest caz, a fost studiat aranjamentul sintelic (sora kinetochores atașată la microtubuli care provin din același ax). Analiza Timelapse a mitozei a fost efectuată pe celule Drosophila S2 care exprimă stabil CID-mCherry pentru vizualizarea centromerelor și GFP-a-tubulină pentru microtubuli. Vizualizarea kinetochorelor este solicitantă datorită dimensiunilor mici, semnalului fluorescent scăzut și aspectului scurt în timpul diviziunii celulare. Microscopia fluorescentă confocală este adesea folosită pentru a imagina kinetochores, cu toate acestea, chiar și în acest mediu, vizualizarea rămâne dificilă., Kinetochorii sunt foarte mici (300 nm) 3, aproape de capacitățile de rezolvare laterală ale microscopului luminos și depășesc capacitatea de rezolvare axială a microscopului. Mai mult, markerii fluorescenți imagistici din celulele vii prezintă potențiale efecte fototoxice și fotobleaching. Iluminarea intensă cu laser poate crea probleme de fototoxicitate, în special dăunătoare pentru celulele vii, care se divid.Andor ‘ s Revolution XD spinning disk confocal microscopy este folosit pentru a depăși provocarea unică a Dr.Moutinho dos Santo asociată cu observarea kinetochores., În acest caz, patru factori trebuie să fie simultan abordate în mod adecvat pentru a vizualiza dinamic de procese celulare:

  • Viteza de achiziție
  • Spațiale și temporale capacitate de rezolvare
  • capacitatea De a detecta foarte scăzut intensitatea fluorescenței niveluri
  • Managementul disponibile fluorescenta a semnalului

Aceste teme spațiale, temporale și intensitatea rezoluție reapar frecvent cu microscopia de fluorescență și de multe ori sunt în contradicție cu experimente care implică observarea viabilității celulare., De exemplu, expunerile lungi ale camerei și perioadele lungi de iluminare de intensitate ridicată generează efectele fototoxice care afectează sau distrug celulele vii. Simultan, ușor etichetat microstructuri cererii de expunere mai lung pentru a vizualiza, dar pot fi afectate în mod negativ de fotooxidare. Compunerea problemei este necesitatea de a combina datele tradiționale tridimensionale cu cele ale timpului. În cele din urmă, rămâne necesar să se discerne semnalul de zgomotul de fond și de ceață outof – focus.viteza de achiziție este de o importanță deosebită pentru Dr. Mountinho dos Santos., Celulele de Control S2 prezintă un ciclu de divizare de aproximativ 30 de minute. Cu toate acestea, celulele S2 epuizate POLO utilizate în experimentele ei au arătat o perioadă arestată de peste opt ore. Înregistrarea diviziunii celulare epuizate POLO necesită colectarea între seturi de imagini 7,200 și 12,000 (două fluorochromuri imaginate la fiecare treizeci de secunde timp de una până la cinci ore, achiziționate la trepte axiale de 0,5 microni până la 20 de pași pentru rezoluția kinetochore axială)., Microscopia fluorescentă convențională și iluminarea cu laser nu vor permite nici cerințele de iluminare blândă necesare, nici viteza de achiziție pentru a finaliza această sarcină sensibilă la timp. De exemplu, cu laser rastering în microscopie confocal tradiționale necesită perioade mai lungi de timp de timp pentru a colecta semnal din eșantion. Spinning disc confocal sisteme sunt folosite pentru a depăși aceste bariere tradiționale și pentru a dezvălui noi perspective în tehnici de editare kinetochore moleculare.,comparativ cu sistemele convenționale de fluorescență widefield, rezoluția spațială a unui disc de filare confocal este superioară atât în dimensiunile laterale (x și y), cât și în cele axiale (z). Prin scanarea constantă a tabloului de găuri, probele pot fi vizualizate în timp real la un contrast ridicat, oferind imagini clare la limitele de difracție ale opticii microscopului. Acest lucru permite vizualizarea 3D și înțelegerea comportamentului kinetochor dinamic în raport cu microtubulii axului., Kinetochore și centromerului laterale rezoluție de 300nm și ax din fibra de rezoluție de 300-500 nm au fost raportate și sunt detaliate în Figura A.

Intensitatea Rezoluție
Vizualizarea etichetati fluorescent kinetochores asociate cu fiecare centromer locuri cerințe suplimentare privind sistemul de achiziție. Centromerii și kinetochorii studiați sunt vizibili în primul rând numai în timpul interfazei diviziunii celulare. Pe măsură ce celulele trec prin profază, centromerii s-au rezolvat deja în cele douăsprezece perechi de cromozomi tipice ale lui Drosophila., Gestionarea bugetului de lumină Disponibil în timpul achiziției de lungă durată necesită o iluminare blândă și o rezoluție înaltă capabilă să se rotească prin tehnici de disc. Deschiderile din unitatea de disc de filare oferă aceste beneficii. Deoarece lumina excită fluoroforii numai atunci când este prezentă o deschidere, efectele fototoxice sunt reduse la minimum. În timp ce contraintuitiv, un buget redus de lumină nu indică obiecte slabe, greu de detectat. Rezoluția de intensitate este mărită prin excluderea discului de filare a semnalului de focalizare și amplificarea ulterioară a semnalului de către o arhitectură a camerei EMCCD., Acest lucru creează noua posibilitate de a genera imagini de contrast mai mari care dezvăluie dezvoltarea și alinierea obiectelor punctate, cum ar fi kinetochores.

Concluzii
utilizarea de disc de filare tehnologie în Dr. Mountinho dos Santos celule vii de aplicare a condus la o observație importantă. În absența kinazei POLO, celulele Drosophila s-au dovedit a fi lipsite de mecanismele corective necesare pentru menținerea aranjamentului cromozomilor amfitelici., Prezența POLO sa dovedit a oferi mediul potrivit pentru arhitectura centromere corectă, asigurând în același timp bi-orientarea cromozomială adecvată. Cultură Drosophila celulele în curs de mitoză în absența POLO kinaza cromozomi atașați la ax fibre cu syntelic orientare, de exemplu, cu sora kinetochores atașat la microtubuli care vin dintr-un singur ax pol.această concluzie a fost trasă prin analiza atentă a microscopiei fluorescente 4D în celulele care exprimă markerul centromer/ kinetochor marcat fluorescent și microtubuli. (Figura 1).