observație
o mare parte din progresul în microbiologie a depins de studiul „culturilor pure.”Acestea sunt culturi care conțin un singur tip de celulă, în mod ideal cu cultura derivată dintr-o singură celulă inițială., De la dezvoltarea timpurie a metodelor de stabilire a culturilor pure (1), au existat multe exemple în care culturile care au fost considerate inițial pure au fost ulterior găsite să conțină două tipuri de microbi. În unele cazuri, aceste culturi multispecifice inadvertente au dus la progrese importante, cum ar fi descoperirea transferului de hidrogen interspecific (2). Cu toate acestea, odată cu apariția tehnologiilor de secvențiere profundă, s-ar putea anticipa în mod rezonabil că contaminanții nedetectați din culturi nu ar mai fi o preocupare semnificativă.,
Geobacter sulfurreducens tulpina PCA a fost izolat în mijlocul anilor 1990, prin utilizarea standard de îmbogățire și tehnica de izolare, care a inclus diluarea până la dispariție în mediu lichid, urmat de repetate dungi de colonii izolate pe agar-mediu solidificat (3). Aceasta este strategia clasică predată în cele mai populare manuale introductive de Microbiologie (4-6). Ulterior, tulpina DL1 de G. sulfurreducens a fost obținută prin restrângerea suplimentară a coloniilor PCA izolate (7). Odată cu dezvoltarea metodelor de manipulare genetică a lui G. sulfurreducens (7) și secvențierea genomului său (8), G., sulfurreducens devenit Geobacter specii de alegere pentru studiul fiziologiei și roman extracelular transfer de electroni proprietățile acestui mediu important gen (9). Secvențierea inițială a genei 16S rRNA în cultură (3), precum și secvențierea genomului mai întâi la 8 ori (8) și apoi la 80 ori (10, 11) acoperire, a indicat că cultura conținea o singură tulpină.,
în încercarea de a evolua adaptiv DL1 pentru a produce mai mult curent, a fost inoculat într-un sistem bioelectric cu un anod de grafit pregătit la un potențial (-400 MV față de Ag/AgCl) considerat a fi aproape de limita inferioară la care ar fi posibilă generarea curentă din acetat (12). Un izolat obținut din biofilmul anodic, desemnat G., sulfurreducens tulpina KN400 (12), este superior inocul tulpina în producerea de curent electric, iar această superioritate este atribuită cel puțin în parte, la capacitatea sa de a produce mai mult „microbiene nanofire,” conductoare electric filamente de proteine care prezintă metalice-cum ar fi conductivitatea electrică (13, 14).inițial s-a presupus că tulpina KN400 a acumulat una sau mai multe mutații care i-au sporit capacitatea de transfer de electroni extracelulari., Acest lucru ar fi analog cu selecția tulpinilor mutante în timpul evoluției adaptive a tulpinii DL1 pentru schimbul de electroni cu alte organisme (11) sau cu rate mai mari de reducere a oxidului de Fe(III) (10). Cu toate acestea, genomica comparativă a arătat că secvența genomului tulpinii KN400 conținea mai mult de 27,270 polimorfisme nucleotidice unice (SNPs) (15). O treime din gene au avut cel puțin un polimorfism nucleotidic, iar un sfert au avut un polimorfism care a afectat secvența proteică rezultată (15). Pe baza ratelor tipice de mutație de 6.,3 × 10-9 / bp pe generație (16), ar dura mai mult de 1.000 de ani pentru a acumula acest număr de mutații în tulpina DL1. În plus, nu există ortologii în tulpina DL1 pentru 139 dintre cadrele de citire deschise (ORFs) din genomul tulpinii KN400, majoritatea fiind strâns legate de genele din organisme diverse filogenetic (15).
Aceste considerente și faptul că Orf-uri unice pentru KN400 nu au fost detectate atunci când cultura de inocul fost modificate (10, 11) a condus la ipoteza că KN400 intrat în bioelectrochemical sistem ca un contaminant., Pentru a evalua această posibilitate, puritatea culturii DL1 a fost evaluată în continuare cu o sensibilitate și mai mare.atât DL1 cât și KN400 conțin OMC, o genă pentru un citocrom de suprafață exterioară care are una dintre cele mai mari proporții de SNP (36 SNP/kb) între cele două tulpini (15). Această genă a fost amplificată din cultura DL1 care a fost utilizată pentru inocularea sistemului bioelectrochimic, iar produsele PCR au fost secvențiate cu Illumina Hi-Seq 2000 (vezi textul S1 din materialul suplimentar)., La KN400 secvență a fost detectat, indicând faptul că KN400 a fost prezent în initiala de inocul folosit pentru anod selecție de studiu. Cu toate acestea, din >107 secvențe de înaltă calitate recuperate, doar 286 au fost secvențe KN400 față de 1,5 × 107 secvențe DL1 (Tabelul 1).
Text S1
Copyright © 2013 Shrestha și colab.
acesta este un articol cu acces deschis distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution – Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea necomercială nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originală să fie creditate.,
- Vizualizare inline
- Afișare pop-up
Estimări de tulpina KN400 abundență în diferite culturesa
Tabel S1
Copyright © 2013 Shrestha și colab.
acesta este un articol cu acces deschis distribuit în condițiile Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Licență Neportată, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea necomercială nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originală să fie creditate.
abundența relativă de KN400 tulpina în acest fel cultura a fost ulterior evaluate prin PCR cantitativ (qPCR) cu un grund specifice stabilite pentru o genă găsit numai în KN400 (a se vedea Textul S1 și Tabelul S1 din material suplimentar) și un primer stabilit că detectat atât KN400 și DL1 (a se vedea Tabelul S1 din material suplimentar)., Abundența relativă a secvenței specifice KN400 a fost similară cu cea a secvențelor omcS KN400 determinate de abordarea secvențierii (Tabelul 1). Analiza secvenței și analiza qPCR a culturii PCA depuse la ATCC au evidențiat prezența KN400 la o abundență similară scăzută (Tabelul 1).
Am încercat pentru a elimina rare KN400 contaminant din DL1 cultura de repetate restreaking de izolat colonii crescute pe solidificat acetat-fumarat de mediu (7), dar KN400 tulpina a continuat să persiste la o frecvență mai mică în colonii izolate (Tabelul 1)., Cu toate acestea, o cultură în care KN400 nu mai putea fi detectat fost obținute în lichid acetat-fumarat de mediu (a se vedea Textul S1 din material suplimentar), în care cea mai mare diluție prezintă creșterea a fost supus la mai multe runde succesive de serie de diluare (Tabelul 1). Acest lucru a demonstrat că tulpina DL1 nu necesită prezența rară a KN400 pentru a crește în mediul acetat-fumarat pe care această cultură este menținută în mod obișnuit.
atunci Când pur KN400 și KN400-gratuit DL1 culturii au fost inoculate în acetat-fumarat de mediu în cantități egale, DL1 depășite KN400 (Fig., 1a). Acest lucru este în concordanță cu constatarea că, atunci când cele două tulpini au fost cultivate separat, DL1 crescut mult mai repede decât KN400 (densitatea optică la 600 nm de 0,04 pentru KN400 versus 0.65 pentru DL1 după 36 de ore de incubare; a se vedea Fig. S2 în materialul suplimentar) în același mediu. Proporția de KN400 a continuat să scadă cu transferuri consecutive (1% inocul) până la abundența de KN400 a fost comparabilă cu cea în APC și DL1 culturile stoc (a se vedea Textul S1 din material suplimentar). KN400 a persistat la acest nivel scăzut cu transferuri suplimentare (Fig. 1a).,
figura S2
Copyright © 2013 Shrestha și colab.
acesta este un articol cu acces deschis distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution – Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea necomercială nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originală să fie creditate.,
Creșterea și activitatea de tulpina KN400 sub diferite condiții de creștere. (a) abundența Relativă de KN400 în succesive mid-log transferuri (1% inocul) de o cultură a inițiat cu proporții egale de KN400 și DL1. Rezultatele sunt mijloacele și abaterile standard ale culturilor triplicate. (b) producția curentă atunci când cultura DL1 a fost introdusă în camera anodică a unui sistem bioelectrochimic cu un anod de grafit gata la -400 mV față de Ag/AgCl. Cultura fără KN400 nu a produs niciun curent în această perioadă., (c) abundența relativă a KN400 în biofilmele anodice, atunci când inoculul inițial a fost cultura DL1, s-a constatat ulterior că conține și KN400. Rezultatele sunt mijloacele și abaterile standard ale culturilor triplicate.încercările repetate de a dezvolta cultura DL1 fără KN400 pe un anod pregătit la -400 mV nu au avut succes. Cu toate acestea, curentul a fost ușor produs într-un alt set de experimente în care cultura DL1 care conține KN400 a servit ca inocul (Fig. 1b)., Un test qPCR al ADN-ului extras din biofilmul anodic a indicat că 100% din secvențele omcS au fost KN400 în cadrul celui de-al doilea transfer (Fig. 1C). Aceste rezultate au sugerat că motivul pentru care KN400 a apărut pe anozi a fost că tulpina DL1 nu a putut să crească în condițiile impuse. Fără acest neobișnuit selectivă presiune, KN400 ar fi rămas nedetectate în APC și DL1 culturi chiar de disponibil în prezent next-generation sequencing metode care pot oferi teoretic thousandsfold acoperire în secvențierea genomului.,factorii care contribuie la persistența pe termen lung a tulpinii KN400 la frecvență extrem de scăzută în cultura DL1 rămân un mister. Importanța fizic izolarea singur celulelor prin metode mai definitiv decât dungi pe mediu solid pentru a stabili culturi pure a fost recunoscut de ceva timp (17), și din ce în ce mai sofisticate metode pentru realizarea acestui continua să fie dezvoltat (18-23)., Cu toate acestea, metodele de placare care sunt utilizate de mai bine de 100 de ani și sunt predate fiecărui student la microbiologie ca proceduri standard pentru obținerea culturilor pure (4-6) rămân cele mai frecvente. Rezultatele prezentate aici demonstrează că, fără izolarea unei singure celule, contaminanții criptici pot supraviețui la o frecvență foarte scăzută în culturi de-a lungul deceniilor de investigare intensivă și pot scăpa de detectare chiar și prin cele mai sofisticate metode de secvențiere disponibile în prezent.,
figura S1
Copyright © 2013 Shrestha și colab.
acesta este un articol cu acces deschis distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution – Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea necomercială nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originală să fie creditate.,