Introducere
Ambergris, un produs natural cunoscut al balenei de spermă , se găsește și ca jetsam pe plajele din întreaga lume și a fost foarte apreciat pentru utilitatea sa în industria parfumurilor . Deși s-a considerat mult timp că ambergrisul jetsam colectat pe plaje provine din balene de spermă , s-au publicat vreodată puține sau deloc dovezi pentru acest lucru și există distincții între astfel de probe și mostre de ambergris prelevate direct din balene de spermă., De exemplu, probele de Ambergris jetsam conțin, în general, proporții mult mai mari ale ambreinei alcoolice triterpenoide și proporții mult mai mici de steroli decât probele de ambergris din balenele de spermă . Dimpotrivă, deși, jetsam ambergris uneori conține fragmente de ciocuri calmar , și deoarece cefalopode, cum ar fi calmar, constituie componenta dietetice majore de balene sperma, acest lucru a fost citat ca dovadă de o origine a coprolitilor jetsam din balene sperma. Este chiar teoretizat ambergris poate proveni ca o secreție patologică de iritant de chitină calamar dur cioc ., Cu toate acestea, alte speciilor de mamifere marine (de exemplu, membrii de Globicephala și Ziphiidae), de asemenea, preced pe calmar , și unele (inclusiv pitic și cormoranul balene sperma) sunt, de asemenea, menționate ca surse potențiale de ambră . Prin urmare, pentru a elucida originea jetsam ambră, am analizat ADN-ul dintr-o ambră colectate de la un eșantion de spermă de balenă eșuată în țările De Jos și l-a comparat cu secvente de ADN izolat din deseurile ambră colectate de pe plajele din Noua Zeelandă și Sri Lanka.,Ambergrisul este considerat a fi predominant compus din ambreină datorită producției sale din squalen, un produs metabolic comun în multe organisme . Acest proces poate fi indus de influența microbiană intestinală și precipită în mase dense și solide din colonul balenei . La coprolitic acumulări care rezultă sunt compozițional bine-potrivite pentru conservarea ADN-ul din colon, deoarece ambrein este hidrofob și se pare că rezistent la degradarea în acid enteric mediu., Dovezile din radiocarbon datare indică cu siguranță rezistența la microbiene și foto-degradare în mediul marin de până la un mileniu, în unele probe jetsam ambergris . Am emis ipoteza că un astfel de material ar putea oferi un cache oportun pentru conservarea ADN-ului, chiar și după expunerea prelungită la condiții dăunătoare pe mare.
Material și metode
specimene de ambergris Jetsam din Marea Nordului, Oceanul Indian și Pacific au fost analizate, reprezentând distribuția globală a materialului ., Trei exemplare jetsam ambergris (unul din Sri Lanka, două din Insula Pitt, Noua Zeelandă) au fost subsamplate pentru extracția ADN-ului. Un al patrulea specimen provine din disecția unei balene de spermă masculină eșuată în decembrie 2012, la Razende Bol lângă Texel, Olanda. Această din urmă ambră „proaspătă”, provenită dintr-o carcasă de cașalot confirmată, a oferit o comparație cunoscută cu specimenele jetsam cu istoric biologic neconfirmat. Probele de ambră au fost obținute și analizate pentru conținutul de ambreină și sterol în materiile fecale în studiile anterioare .,extracția și secvențierea ADN-ului au fost efectuate la Institutul GLOBE, Universitatea din Copenhaga, într-un laborator dedicat ADN-ului antic, urmând proceduri stricte pentru minimizarea contaminării. Aproximativ 120 mg au fost subeșantionate (figura 1 și tabelul 1) pentru extracția ADN-ului. Probele au fost incubate în tampon conținând 400 µl proteinază k după Gilbert et al. la 56°C timp de 10 ore; supernatanții au fost apoi tratați folosind un pas fenol–cloroform după Carøe et al., și purificat folosind Monarch coloane de curățare a ADN-ului (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, SUA) în conformitate cu liniile directoare ale producătorului. Bibliotecile dublu-catenare au fost construite din extracte de ADN după cel mai bun protocol , concepute și dovedite special pentru secvențierea ADN-ului vechi și degradat. Bibliotecile au fost amplificate și indexate prin PCR folosind PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) în conformitate cu liniile directoare ale producătorului., Produsele au fost grupate la concentrație echimolară înainte de secvențiere pe o platformă Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, SUA), folosind 80 bp single end read chemistry la Centrul național danez de secvențiere ADN de mare capacitate, Copenhaga, Danemarca.
Figura 1. Detalii pentru probele de ambră analizate. (a) Harta localităților în care au fost găsite inițial mostre de ambră., (b) Fotografii care arată o mare diversitate în caracteristicile fizice ale ambră fragmente: TEXEL151212 (de la disecat balena specimen) a fost granulată în consistență, în timp ce jetsam probe superficial apărut mai dens și eterogene, și au fost pe plan intern equigranular și semnificativ mai palid la culoare.
| exemplu | localizare | masa totală (g) | analizat în masă (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Insula, Noua Zeelandă | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | vest de Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Olanda | 83000 | 92 | 93 |
| exemplu | total reținut citește | medie reținute citit lungime (bp) | total aliniat citește (mtDNA) | ori de acoperire (mtDNA) | total aliniat citește (întregul genom) | ori de acoperire (întregul genom) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Secvență analiza a fost realizată pe calcul de înaltă performanță facilitatea de la Universitatea din Copenhaga, cu FASTQ fișierele prelucrate cu ajutorul PALEOMIX conducte (v. 1.2.13) . FastQC V. 0.11.8 a fost inițial utilizat pentru controlul calității datelor secvenței brute. Adaptoare au fost tăiate folosind AdapterRemoval v. 2.3.1, cu Citește mai puțin de 25 bp, de asemenea, eliminate. Citirile au fost apoi mapate la secvențe de referință folosind BWA , aplicând și mapDamage2.,0 pentru cuantificarea degradării de bază, producând aliniamente cu secvențe de referință. ANGSD a fost apoi folosit pentru a produce secvențe în format FASTA.
incertitudinea în jurul originii și a mecanismelor biologice pentru producerea ambergrisului ne-a determinat să luăm în considerare mai multe specii de cetacee și pinipede posibile în analiza secvenței. Identitatea speciilor a fost dedusă prin succesul cartografierii și relația filogenetică cu 19 specii candidate cetacee și pinipede în NCBI RefSeq (a se vedea materialul electronic suplimentar)., Aceste specii au fost selectate pe baza adecvării potențiale ca mamifere marine care se scufundă adânc, umplând o nișă ecologică similară cu balenele de spermă, pentru a exclude ca aceste specii să fie co-adaptate pentru a produce ambră. Secvențele de eșantioane au fost concatenate și aliniate folosind MAFFT v .7.392. Arborele filogenetic modele s-au produs apoi în MEGA X folosind la maxim-risc metoda cu Hasegawa–Kishino–Yano model , cu distanțe estimată de maxim compozit probabilitatea abordare (detalii ale tuturor secvențelor de referință utilizate sunt incluse în sistemul electronic de materiale suplimentare).,
rezultate
analizele filogenetice au susținut fără echivoc originea cașalotului din cele patru probe de ambră (figura 2; material suplimentar electronic, figura S1). De asemenea, alinierea cu genomul de referință mitocondrial Physeter macrocephalus de la NCBI (NC_002503.2) a produs cele mai mari rezultate de acoperire pentru toate probele din toate aliniamentele făcute și oferă o atribuire încrezătoare, deși cu variații semnificative de succes între probe. Secvențierea probei dintr-o balenă de spermă eșuată (TEXEL151212) a produs de departe cea mai mare acoperire (aprox., 20×) pentru balene sperma mitocondrie, în timp ce unul dintre jetsam probe de la Pitt Insulă (S. 01) numai cedat aproximativ 0,2× acoperire (a se vedea tabelul 2). Aliniamente cu Kogia sima (cașalot pitic) și Kogia breviceps (cașalot pitic) de referință mitocondrial genomul (NC_041303.1, NC_005272.1) dat, de asemenea, de acoperire (detalii în format electronic materiale suplimentare), deși mulți înalt conservată regiuni funcționale sunt partajate între specii analizate, care rezultă în mare similaritate de secvență . Cu toate acestea, acoperirea pentru speciile de kogiide a fost de obicei în jurul unui factor de 10 mai mic decât pentru Physeter., Alinierea cu genomul de referință nuclear P. macrocephalus (ASM283717v2) a fost de asemenea reușită, deși acest lucru este mai evident în comparațiile numărului total de citiri mapate la genom. Alinierea pentru Architeuthis dux( squid gigant ), o pradă comună reputată a balenelor de spermă (de exemplu), nu a reușit, dar aceasta nu este prada lor predominantă .
Figura 2. Model de arbore filogenetic cu probabilitate maximă generat din secvențe de referință și genomuri mitocondriale de probă aliniate., Probele sunt situate în mod clar ca grupare cu balena spermatozoidă (P. macrocephalus), mai degrabă decât cu balenele pitice și pitice (Kogia spp.). Acest arbore reflectă cel mai mare model de log-probabilitate, valorile reflectă procentul de arbori calculat în care taxonii asociați au fost grupați, indicând încrederea în poziționare, iar lungimile ramurilor măsoară numărul de substituții la fiecare sit (vezi scala). Figura produs în MEGA X . Descrierea balenelor din: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Un arbore filogenetic care include toate cele 19 specii candidate este prezentat în materialul electronic suplimentar, figura S1.
Rezultatele de la MapDamage arată extrem de mici, inter-proba de variație afectează C a T tranziții de la 5′ fir se termină, deși un procent mai mare de G a Unei tranziții de la capătul 3′ există pentru S. 01 (detalii în format electronic, materiale suplimentare, figura S2), indicând posibile mai mare biomoleculare de degradare., În general, însă, s-au produs foarte puține modificări chimice, iar distribuția modificărilor pe fire rămâne uniformă și plată.acest studiu a demonstrat că trei probe de Ambergris jetsam pot fi atribuite cu încredere balenelor de spermă prin extracția ADN-ului. În timp ce confirmarea originii unei balene de spermă pentru Ambergris jetsam nu este un rezultat surprinzător, prezentul studiu este primul în furnizarea unei dovezi semnificative a conceptului în recuperarea ADN-ului endogen din ambergris și utilizarea cu succes a acestuia pentru identificarea organismului., Important, originea toate cele trei jetsam ambră probe studiat aici, încredere poate fi identificat ca balena sperma pe baza nu numai genetic aliniere succes, dar, de asemenea, de modelare a mitocondrial genomul în înrudirii filogenetice copaci, inclusiv pentru un eșantion mare de outgroup mamifer marin taxoni., Cu toate acestea, deși toate probele analizate aici au fost identificate ca provenind de la balene spermatice, este încă destul de posibil ca alte mamifere marine aflate în strânsă legătură în scufundări adânci (cum ar fi balenele pitice și pitice) să producă ambră și pur și simplu nu au fost înregistrate ca făcând acest lucru până în prezent.cauza predominantă a variației dramatice a acoperirii genetice observate între probe este neclară. Analiza degradării ADN în mapDamage2.,0 arată corelație cu alinierea reportaje, cum ar fi de așteptat, și există, de asemenea, o mică variație între ambrein conținut în probele care ar putea fi de așteptat să contribuie la diferențial ADN conservare. Vârsta exactă a probelor jetsam prezente nu este cunoscută, deși studiile anterioare au dat cu succes radiocarbon alte probe de ambră . Cu toate acestea , datarea cu radiocarbon a probelor relativ recente este problematică datorită impactului emisiilor de combustibili fosili, iar datele cu radiocarbon de la creșterea eliberării de carbon antropic sunt nesigure., Producerea unei rate de degradare consistente pentru tranzițiile de la G la A în probele mai vechi datate în mod fiabil ar putea, în viitor, să ajute la o mai bună înțelegere a daunelor ADN diferențiale. O altă opțiune pentru cercetările viitoare ar putea fi studiile privind deamidarea glutaminei și racemizarea acidului aspartic din analiza peptidelor organice, eventual prezente și în ambergris . Cu toate acestea, în mod alternativ, variația intra-eșantion a concentrației de ADN și ambreină ar putea la fel de probabil să reprezinte o acoperire scăzută în proba S.,01, în timp ce expunerea mai recentă la țesutul de balenă de spermă reprezintă, fără îndoială, acoperirea ridicată în proba de balenă eșuată TEXEL151212.potențialul de conservare al ambreinei precipită pentru ADN se extinde nu doar la genetica endogenă a balenelor, ci și la acoperirea metagenomică a microbiomului intestinului balenei și, eventual, și ADN-ul prăzii lor. De exemplu , ADN-ul poate rămâne , de asemenea, în ciocurile de calmar parțial sau nedigerate găsite în materiile fecale ale balenelor de spermă și în ambră, care sunt chiar teoretizate ca fiind o cauză patologică a secreției de ambră ., Înțelegerea procariote compoziția microbiomului mediu în ambră ar putea, de asemenea, în continuare elucida originea ambră, în special în conversie de scualen să ambrein și procesul prin care ambră pare să se formeze în straturi de acumulare. Analize suplimentare privind recuperarea ADN-ului endogen de la jetsam ambergris, inclusiv, de asemenea, ADN-ul de la balena intestin microbiota și pradă, ar da perspective semnificativ mai mare în balena sperma Ecologie, evoluția și metabolismul.,
concluzie
Jetsam ambergris a fost mult timp un material enigmatic, supus discuțiilor și analizelor în publicațiile științifice încă din secolul al XVIII-lea . Acest studiu este primul din cunoștințele noastre care prezintă confirmarea finală a originii biologice a probelor de Ambergris jetsam ca balene de spermă, prin analiza ADN. Dincolo de aceasta, însă, studiul de față prezintă potențialul ambergrisului ca o nouă sursă de date genetice legate de balenele de spermă cu o longevitate considerabilă de-a lungul timpului., O mai mare elucidare rămâne de realizat prin studiul condițiilor de conservare a ADN-ului în ambreină și a efectelor diferențiate de la mai mulți factori. Cu toate acestea, implicațiile potențiale pentru a ne ajuta să înțelegem dinamica populației din trecut în balene și taxonii lor asociați ecologic pot fi profunde. Cele mai vechi-cunoscute ambră găsite în depozite Pleistocen caracteristică permineralized ciocuri calmar care conțin aminoacizi endogeni la calmar, care autorii atribuie capacitatea de conservare a sedimentelor locale ., Deși este puțin probabil ca ADN-ul să fie păstrat pentru o astfel de vârstă (1,75 Ma), această constatare ar putea fi, de asemenea, atribuibilă eficacității ambergrisului și ambreinei ca substraturi de conservare. O mare este încă necunoscut despre ecologia și adaptarea giganți marine caracterizate anterior ca fiare semi-mitice, și ambergris poate dovedi acum o cheie mică, dar semnificativă pentru a înțelege unele aspecte suplimentare ale acestora.
etică
toate probele au fost obținute și analizate etic în acest studiu, parte a proiectului DNRF-128 PROTEIOS., Dintre cele patru ambră probe analizate în acest studiu, trei (S. 01 S. 03) au fost subsampled din materialul studiat de către S. J. R. în prealabil publicații (vezi mai sus), obținut ca jetsam ambră găsit pe plaje (proba nr. ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 și ACL237-S. 03). Cea de-a patra probă (TEXEL151212) a fost cu amabilitate furnizate ca un subeșantion de ambră specimen TEXEL151212 de Dr. A. Oosterbaan pe numele EcoMare Muzeu, Texel, Olanda, unde restul de această probă este încă loc. Suntem recunoscători pentru permisiunea Muzeului de a folosi această mostră.,
accesibilitatea datelor
contribuțiile autorilor
interese concurente
declarăm că nu avem interese concurente.
finanțarea
finanțarea a fost asigurată de Fundația Națională de cercetare Daneză grant PROTEIOS (DNRF128).
mulțumiri
R. M. este recunoscător Dr. J. A. Samaniego pentru sfaturi privind analizele genomice și, de asemenea, M. McCarthy pentru sfaturi și discuții. Suntem recunoscători pentru Dr. A. Oosterbaan (Ecomare Muzeu, Texel) pentru proba S. 04 și să anonime colectoare pentru probele S. 01–S. 03., Autorii ar dori să recunoască Asistența Centrului național danez de secvențiere cu randament ridicat în generarea de date Illumina.
note de subsol
materialul suplimentar Electronic este disponibil online lahttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
publicat de Royal Society sub termenii licenței Creative Commons Attributionhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, care permite utilizarea nerestricționată, cu condiția ca autorul original și sursa să fie creditate.