Beobachtung
Ein Großteil der Fortschritte in der Mikrobiologie hing von der Untersuchung von „Reinkulturen“ ab.“Dies sind Kulturen, die nur einen Zelltyp enthalten, idealerweise mit der Kultur, die von einer anfänglichen Einzelzelle abgeleitet ist., Seit der frühen Entwicklung von Methoden zur Etablierung reiner Kulturen (1) gab es viele Beispiele, in denen Kulturen, die ursprünglich als rein galten, anschließend zwei Arten von Mikroben enthielten. In einigen Fällen haben diese unbeabsichtigten Multispezies-Kulturen zu wichtigen Durchbrüchen geführt, wie zum Beispiel der Entdeckung des Wasserstofftransfers zwischen den Spezies (2). Mit dem Aufkommen von Deep-Sequenzierungstechnologien könnte jedoch vernünftigerweise vorhergesagt werden, dass unentdeckte Verunreinigungen in Kulturen kein signifikantes Problem mehr darstellen.,
Der Geobacter sulfurreducens-Stamm PCA wurde Mitte der 1990er Jahre unter Verwendung von Standardanreicherungs-und Isolationstechniken isoliert, die die Verdünnung bis zum Aussterben in flüssigem Medium beinhalteten, gefolgt von wiederholten Streifen isolierter Kolonien auf agar-erstarrtem Medium (3). Dies ist die klassische Strategie, die in den beliebtesten Einführungslehrbüchern für Mikrobiologie (4-6) gelehrt wird. Später wurde der G. sulfurreducens-Stamm DL1 durch zusätzliches Restreaking isolierter PCA-Kolonien erhalten (7). Mit der Entwicklung von Methoden zur genetischen Manipulation von G. sulfurreducens (7) und der Sequenzierung seines Genoms (8), G., sulfurreducens wurde die Geobacter-Spezies der Wahl für das Studium der Physiologie und der neuartigen extrazellulären Elektronentransfereigenschaften dieser ökologisch wichtigen Gattung (9). Die anfängliche Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens in der Kultur (3) sowie die Sequenzierung des Genoms zuerst auf 8-fache (8) und dann auf 80-fache (10, 11) Abdeckung zeigten, dass die Kultur nur einen Stamm enthielt.,
In einem Versuch, DL1 adaptiv zu entwickeln, um mehr Strom zu erzeugen, wurde es in ein bioelektrisches System mit einer Graphitanode beimpft, die auf ein Potenzial (-400 mV gegenüber Ag/AgCl) eingestellt war, das als nahe an der unteren Grenze angesehen wurde, an der eine Stromerzeugung aus Acetat möglich wäre (12). Ein Isolat aus dem Anoden-Biofilm, bezeichnet G., der schwefelreduzierende Stamm KN400 (12) ist dem Inokulumstamm bei der Erzeugung von elektrischem Strom überlegen, und diese Überlegenheit wird zumindest teilweise seiner Fähigkeit zugeschrieben, mehr „mikrobielle Nanodrähte“ elektrisch leitfähige Proteinfilamente zu erzeugen, die eine metallische elektrische Leitfähigkeit aufweisen (13, 14).
Es wurde zunächst angenommen, dass der Stamm KN400 eine oder mehrere Mutationen akkumuliert hatte, die seine Kapazität für den extrazellulären Elektronentransfer erhöhten., Dies wäre analog zur Selektion für mutierte Stämme während der adaptiven Evolution des Stammes DL1 für den Elektronenaustausch mit anderen Organismen(11) oder höheren Raten der Fe (III) – Oxidreduktion (10). Die vergleichende Genomik ergab jedoch, dass die Genomsequenz des Stammes KN400 mehr als 27.270 einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) enthielt (15). Ein Drittel der Gene hatte mindestens einen Nukleotidpolymorphismus und ein Viertel einen Polymorphismus, der die resultierende Proteinsequenz beeinflusste (15). Basierend auf typischen Mutationsraten von 6.,3 × 10-9 / bp pro Generation (16) würde es mehr als 1.000 Jahre dauern, diese vielen Mutationen im Stamm DL1 anzusammeln. Des Weiteren gibt es keine Orthologen im DL1-Stamm für 139 der offenen Leserahmen (ORFs) im KN400-Stammgenom, von denen die meisten am engsten mit Genen in phylogenetisch vielfältigen Organismen verwandt sind (15).
Diese Überlegungen und die Tatsache, dass die ORFs, die für KN400 einzigartig sind, nicht nachgewiesen wurden, als die Inokulumkultur erneut sequenziert wurde (10, 11), führten zu der Hypothese, dass KN400 als Kontaminant in das bioelektrochemische System gelangt ist., Um diese Möglichkeit zu bewerten, wurde die Reinheit der DL1-Kultur weiter mit noch höherer Empfindlichkeit bewertet.
Sowohl DL1 als auch KN400 enthalten omcS, ein Gen für ein Cytochrom der äußeren Oberfläche, das einen der höchsten Anteile an SNPs (36 SNPs/kb) zwischen den beiden Stämmen aufweist (15). Dieses Gen wurde aus der DL1-Kultur amplifiziert, die zur Inokulation des bioelektrochemischen Systems verwendet worden war, und die PCR-Produkte wurden mit Illumina Hi-Seq 2000 sequenziert (siehe Text S1 im Ergänzungsmaterial)., Die KN400-Sequenz wurde nachgewiesen, was darauf hinweist, dass KN400 in dem anfänglichen Inokulum vorhanden war, das für die Anodenauswahlstudie verwendet wurde. Von den >107 hochwertigen Sequenzen wurden jedoch nur 286 KN400 Sequenzen gegenüber 1,5 × 107 DL1 Sequenzen wiederhergestellt (Tabelle 1).
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Schätzungen der Belastung KN400 in verschiedenen Kultureneine
Tabelle S1
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Die relative Häufigkeit des KN400-Stammes in derselben Kultur wurde weiter durch quantitative PCR (qPCR) mit einem Primersatz, der spezifisch für ein Gen ist, das nur in KN400 gefunden wurde (siehe Text S1 und Tabelle S1 im Ergänzungsmaterial) und einem Primersatz, der sowohl KN400 als auch DL1 detektierte (siehe Tabelle S1 im Ergänzungsmaterial), bewertet., Die relative Häufigkeit der KN400-spezifischen Sequenz war ähnlich der der KN400-omcS-Sequenzen, die durch den Sequenzierungsansatz bestimmt wurden (Tabelle 1). Sequenzanalyse und qPCR-Assay der bei ATCC abgelagerten PCA-Kultur zeigten das Vorhandensein von KN400 bei einer ähnlich geringen Häufigkeit (Tabelle 1).
Wir haben versucht, die seltene KN400-Kontamination aus der DL1-Kultur durch wiederholtes Restreaking isolierter Kolonien, die auf erstarrtem Acetat-Fumarat-Medium (7) gezüchtet wurden, zu entfernen, aber der KN400-Stamm blieb in den isolierten Kolonien weiterhin mit niedriger Frequenz bestehen (Tabelle 1)., Eine Kultur, in der KN400 nicht mehr nachgewiesen werden konnte, wurde jedoch in flüssigem Acetat-Fumarat-Medium (siehe Text S1 im Ergänzungsmaterial) erhalten, in dem die höchste Verdünnung, die Wachstum zeigte, mehreren aufeinanderfolgenden Runden serieller Verdünnung unterzogen wurde (Tabelle 1). Dies zeigte, dass der DL1-Stamm nicht die seltene Anwesenheit von KN400 benötigt, um in dem Acetat-Fumarat-Medium zu wachsen, auf dem diese Kultur routinemäßig aufrechterhalten wird.
Wenn reines KN400 und die KN400-freie DL1-Kultur in gleichen Mengen in Acetat-Fumarat-Medium inokuliert wurden, übertraf DL1 KN400 (Abb., 1a). Dies steht im Einklang mit der Feststellung, dass DL1, wenn die beiden Stämme getrennt gezüchtet wurden, viel schneller wuchs als KN400 (optische Dichte bei 600 nm von 0,04 für KN400 gegenüber 0,65 für DL1 nach 36 h Inkubation; siehe Abb. S2 im Ergänzungsmaterial) im gleichen Medium. Der Anteil an KN400 ging mit aufeinanderfolgenden Transfers weiter zurück (1% Inokulum), bis der Überfluss an KN400 mit dem in den PCA-und DL1-Bestandskulturen vergleichbar war (siehe Text S1 im Ergänzungsmaterial). KN400 beharrte auf diesem niedrigen Niveau mit weiteren Transfers (Abb. 1a).,
Abbildung S2
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das Wachstum und die Aktivität der Stamm KN400 unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. (a) Relative Häufigkeit von KN400 bei aufeinanderfolgenden Mid-Log-Transfers (1% Inokulum) einer Kultur, die mit gleichen Anteilen von KN400 und DL1 initiiert wurde. Die Ergebnisse sind die Mittel – und Standardabweichungen von Triplikatkulturen. (b) Stromproduktion, wenn die DL1-Kultur in die Anodenkammer eines bioelektrochemischen Systems mit einer Graphitanode eingeführt wurde, die bei -400 mV gegenüber Ag/AgCl liegt. Die KN400-freie Kultur erzeugte in dieser Zeit keinen Strom., (c) Relative Häufigkeit von KN400 in Anoden-Biofilmen, wenn das anfängliche Inokulum die DL1-Kultur war, von der anschließend festgestellt wurde, dass sie auch KN400 enthält. Die Ergebnisse sind die Mittel – und Standardabweichungen von Triplikatkulturen.
Wiederholte Versuche, die KN400-freie DL1-Kultur auf einer bei -400 mV balancierten Anode zu züchten, waren erfolglos. Strom wurde jedoch leicht in einem anderen Satz von Experimenten erzeugt, in denen die DL1-Kultur, die KN400 enthielt, als Inokulum diente (Abb. 1b)., Ein qPCR-Assay von DNA, die aus dem Anoden-Biofilm extrahiert wurde, zeigte an, dass 100% der omcS-Sequenzen innerhalb des zweiten Transfers geknotet wurden (Abb. 1c). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass der Grund, warum KN400 an den Anoden auftrat, darin bestand, dass der DL1-Stamm unter den auferlegten Bedingungen nicht wachsen konnte. Ohne diesen ungewöhnlichen selektiven Druck wäre KN400 in den PCA-und DL1-Kulturen selbst durch derzeit verfügbare Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation, die theoretisch tausendfache Abdeckung in der Genomsequenzierung bieten können, unentdeckt geblieben.,
Die Faktoren, die zur langfristigen Persistenz der Dehnung KN400 bei extrem niedriger Frequenz in der DL1-Kultur beitragen, bleiben ein Rätsel. Die Bedeutung der physikalischen Isolierung einzelner Zellen durch Methoden, die definitiver sind als das Streifen auf festem Medium, um reine Kulturen herzustellen, ist seit einiger Zeit bekannt (17), und es werden immer ausgefeiltere Methoden zur Erreichung dieses Ziels entwickelt (18-23)., Die seit mehr als 100 Jahren angewandten Beschichtungsmethoden, die jedem Mikrobiologiestudenten als Standardverfahren zur Gewinnung von Reinkulturen (4-6) beigebracht werden, bleiben jedoch die häufigsten. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass kryptische Kontaminanten ohne Einzelzellenisolierung in Kulturen über Jahrzehnte intensiver Untersuchungen mit sehr niedriger Frequenz überleben und selbst mit den derzeit ausgefeiltesten Sequenzierungsmethoden dem Nachweis entgehen können.,
Abbildung S1
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