hur minnen stör beror på när nytt lärande inträffar
för att testa hypotesen att tidpunkten för den andra träningen är en nyckelfaktor för att bestämma om proaktiv eller retroaktiv störning uppstår, använde vi ett paradigm som var utformat för att undersöka konkurrensen mellan två olika ledtrådar som är utbildade ifrån varandra, men har ett gemensamt resultat, e.,g., samma typ av konditionerat svar23. Specifikt utförde vi en dubbel appetitiv klassisk konditioneringsprocedur som involverar två neutrala kemiska stimuli, gamma-nonalakton eller amylacetat (de konditionerade stimuli), som båda var parade med en framträdande matstimulans (sackaros, den okonditionerade stimulansen) som aktiverar den väl identifierade matningskretsen av Lymnaea11,24,25., En enda parning av antingen konditionerad stimulans med den okonditionerade stimulansen leder till bildandet av långsiktigt aptitretande minne, särskilt med icke-förfallna och förfallna perioder observerade vid samma tidpunkter under minneskonsolidering8,19 (kompletterande Fig. 1). På varandra följande träning med dessa två aptitretande paradigmer användes för att fastställa vilken typ av störningar som uppstod under en icke-lapse jämfört med en förfallotid av samma konsolideringssekvens.,
djur har utbildats med gamma-nonalakton + sackaros ( kallad ”första appetitive training”), och sedan har en andra utbildning av amylacetat + sackaros (kallad ”andra appetitive training”) tillämpats vid antingen en icke-lapse (1 h) eller lapse (2 h) punkt i det första minnet. De testades sedan för närvaro av långsiktigt minne 24 h efter den första träningen (Fig. 1a)., Djur som fick den andra appetitiva träningen vid non-lapse-punkten behöll ett minne för den första konditionerade stimulansen (gamma-nonalakton) men inte för den andra konditionerade stimulansen (amylacetat) (Fig. 1b, ”non-lapse”), som indikerar proaktiv störning, medan djur som fick den andra appetitiva träningen under förfallodagen hade ett minne för den andra konditionerade stimulansen, men inte den första konditionerade stimulansen (Fig. 1B, ’lapse’), indikativ för retroaktiv interferens (gamma-nonalaktontestade djur: envägsanova, p < 0.,001 (F(3,132) = 17.27), Bonferroni test: 1 h vs naïve p < 0.001, first training alone vs naïve p < 0.001, 2 h vs naïve p > 0.05. Amyl acetate tested animals: One-way ANOVA, p < 0.001 (F(3,123) = 9.72), Bonferroni test: 2 h vs naïve p < 0.001, second training alone vs naïve p < 0.001, 1 h vs naïve p > 0.05).
proaktiv och retroaktiv störning och parallell konsolidering av associativa minnen efter enkel rättegång konditionering. en förenklad tidslinje med dubbla aptitretande konditionering paradigm. B-djur visade ett större svar på den första konditionerade stimulansen (CS), gamma-nonalakton (GNL), efter första träningen ensam (n = 40) eller när andra träningen inträffade under non-lapse (1 h: N = 32) men inte lapse (2 h: n = 29) jämfört med naiva kontroller (n = 35)., Svar på den andra konditionerade stimulansen, amylacetat (AA), var större hos djur som fick andra träning enbart (n = 24) eller andra träning under förfallodagen (2 h: n = 31) men inte den icke-lapse (1 h: n = 32) jämfört med naiva kontroller (n = 40). Violin tomter visar tätheten av data som sträcker sig från lägsta till högsta värden. Interna boxplots visar median och interquartile intervall (första och tredje kvartilen). Whiskers representerar minimala till maximala värden. Cirklar visar medelvärdet. C förenklad tidslinje av aptitretande följt av aversiv träning., D djur visade ett större svar på den aptitretande konditionerade stimulansen (gamma-nonalakton) efter aptitär träning ensam (n = 30) eller när aversiv träning inträffade under non-lapse (1 h: n = 29) men inte förfallet (2 h: n = 30) jämfört med naiva kontroller (n = 28). Svar på den aversiva konditionerade stimulansen, L-serin (L-s), var lägre hos djur som fick aversiv träning under förfallodagen (2 h: n = 29), icke-lapse (n = 30) och efter aversiv träning ensam (n = 30) jämfört med naiva kontroller (n = 29). e förenklad tidslinje av aversiv följt av aptitretande träning., f djur visade ett lägre svar på den aversiva konditionerade stimulansen efter aversiv träning ensam (n = 20) eller när appetitiv träning inträffade under non-lapse (1 h: n = 20) men inte förfallet (2 h: n = 20) jämfört med naiva kontroller (n = 20)., Svar på den aptitretande konditionerade stimulansen var större hos djur som fick aptitretande träning under förfallet (2 h: n = 20), non-lapse (n = 16) och efter aptitiv träning ensam (n = 20) jämfört med naiva kontroller (n = 20)
det var möjligt att frånvaron av minne efter störningar berodde på djurets oförmåga att samtidigt lagra två liknande långsiktiga minnen., För att undersöka detta utbildade vi djur med båda typerna av aptitretande paradigmer men fördelade 24 h från varandra, vilket gör att det första minnet kan konsolideras fullständigt före den andra träningen (kompletterande Fig. 2a). Varje djur testades för sitt svar på båda konditionerade stimuli 24 h efter den andra träningen. För att säkerställa att testordningen inte påverkade djurets svar testades en grupp för deras svar på gamma-nonalakton först och sedan amylacetat 1 h senare, medan en andra grupp fick dem i omvänd ordning., Båda grupperna visade ett större svar på båda betingade stimuli jämfört med naiva djur som indikerar närvaron av två minnen i samma djur (kompletterande Fig. 2b).
en alternativ hypotes är att oförmågan att konsolidera båda minnena samtidigt beror på konkurrens mellan två liknande minnen som använder samma underliggande neurala krets. Vi undersökte om samma regler för störningar som tillämpas när den andra träningen använde ett paradigm som använder en krets som skiljer sig från den som aktiveras av det första lärandet., Aversiv konditionering av utfodring i Lymnaea behandlas av en neuronal krets som inte är involverad i livsmedelsbelöningsförhållande26; därför användes ett aversivt paradigm för att testa konkurrenshypotesen. En enda parning av L-serin (en aptitretande stimulans, se Fig. 1D) med kinin (en aversiv stimulans som hämmar feeding27) inducerat långtidsminne, uttryckt som ett minskat matningsrespons på den konditionerade stimulansen, när den testas vid 24 h jämfört med naiva kontroller (naiv matningsdifferens: 21.1 ± 2.5, n = 16, L-serin + kininmatningsdifferens: 9.8 ± 2.,1, n = 17, oparade t-test, p = 0,0016, t = 3,47, DF = 31). I synnerhet under konsolideringen av det aversiva minnet inträffade bortfall samtidigt som under aptitminnesbildning, vilket visar att bortfall är en allmän egenskap under konsolidering i Lymnaea (kompletterande Fig. 3). Därefter utbildades djur med gamma-nonalactone + sackaros ( appetitive training), följt av avversiv träning vid samma non-lapse eller lapse punkter i det första minnet som i det dubbla appetitive paradigmet (Fig. 1c)., Aversiv träning under non-lapse-punkten gav upphov till både ett aptitretande och aversivt minne (Fig. 1D, ”non-lapse”), vilket indikerar frånvaron av proaktiv störning, medan aversiv konditionering under appetitive minne förfaller resulterade i ett aversivt minne, men inte ett aptitretande minne (Fig. 1D, ’lapse’) (gamma-nonalactone testade djur: One-way ANOVA, p < 0,001 (f(3,113) = 9,47), Bonferroni test: 1 h vs naiv p < 0,001, appetitive alone vs naïve p < 0,001, 2 h vs naiv p > 0,05., L-serine testade djur: One-way ANOVA, p < 0.001 (f(3,114) = 12.13), Bonferroni test: aversiv ensam vs naiv p < 0.001, 1 h vs naiv p < 0.001, 2 h vs naiv p < 0,01).
för att testa om bristen på proaktiv interferens mellan appetitive och det aversiva minnet berodde på att den senare var starkare än den förra, och därför mindre benägna att störa, vände vi träningsordningen och utförde aversiv följt av aptitretande träning (Fig. 1e)., Med detta omvända paradigm observerade vi samma mönster av minnesstörningar som när den appetitiva träningen föregick aversiv träning (l-serine tested animals: One-way ANOVA, p < 0.001 (f(3,76) = 7.34), Bonferroni test: 1 h vs naïve p < 0.001, aversive alone vs naïve p < 0,01, 2 h vs naiv p > 0,05. Gamma-nonalactone testade djur: En-vägs ANOVA, p < 0.001 (F(3,72) = 10.18), Bonferroni-test: appetitive ensam vs naiva p < 0.,001 1 h vs naiva p < 0.01, 2 h vs naiva p < 0.001) (Fig. 1f). Tillsammans visar dessa resultat att induktionen av ett nytt associativt minne under det första minnet orsakar retroaktiv störning oavsett om det andra träningsparadigmet är aptitivt eller aversivt. Under den icke-förfallna perioden uppstår proaktiva störningar endast när det andra träningsparadigmet liknar det första. Med ett annorlunda paradigm uppstår dubbel minneskonsolidering., Vi försökte därefter identifiera möjliga neurala mekanismer som ligger bakom dessa skillnader i beteendeuttrycket av en eller annan typ av minne beroende på de paradigmer som används.
hur två minnen stör beror på de kretsar de använder
vi hypoteser att oförmågan att samtidigt konsolidera två aptitretande minnen beror på att båda kodas inom samma minneskrets, medan den aversiva föreningens användning av en distinkt kretsmekanism tillåter dubbel konsolidering utanför förfalloperioderna., En tidigare identifierad cellulär förändring som är involverad i långtidsminnet efter aptitretande konditionering i Lymnaea är den ihållande depolariseringen av en modulatorisk neuron i matningsnätet, CGCs (cerebrala jätteceller)9,28,29. De inlärningsinducerade depolarisationsportarna-i den konditionerade stimulansinmatningen till utfodring av kommandoliknande interneuroner, vilket i utbildade djur resulterar i aktivering av matningsnätet9. Här visar vi att båda typerna av aptitretande träning inducerar samma ihållande depolarisering jämfört med naiva kontroller (One-way ANOVA, p < 0.,001 (f(2,35) = 26,3), Bonferroni test: första träning ensam vs naiv p < 0,001, andra träning ensam vs naiv p < 0,001, första träning ensam vs andra träning ensam p > 0,05) (Fig. 2a–c). Vi testade därefter om aversiv konditionering påverkade CGCs och fann ingen signifikant förändring i deras membranpotential jämfört med naiva kontroller (oparade t-test, p = 0.53, t = 0.63, DF = 22) (Fig. 2d–f)., Det fanns ingen förändring i CGC membranresistens eller spik egenskaper efter antingen aptitretande eller aversiv konditionering (CGC membranresistens: aptitretande träning, enkelriktad ANOVA, p = 0.17 (F(2,34) = 1,77). Aversiv träning, oparad t-test, p = 0,67, t = 0,44, DF = 22.) (Fig. 2C, f; kompletterande Fig. 4a, B). Därför inducerar båda appetitiva paradigmer samma cellulära förändring, medan aversiv träning inte påverkar egenskaperna hos denna neuron vilket tyder på att minnet kodas i en annan krets.
olika neuronala substrat för aptitretande kontra aversivt lärande. ett representativt spår av CGC-aktivitet 24 h efter att djuren fått första eller andra aptitretande träning ensam och från naiva djur. B CGCs från både första (n = 12) och andra (n = 13) aptitretande träningsgrupper var depolarisering jämfört med naiva kontroller (n = 13) men inte jämfört med varandra. Violin tomter visar tätheten av data som sträcker sig från lägsta till högsta värden. Interna boxplots visar median och interquartile intervall (första och tredje kvartilen)., Whiskers representerar minimala till maximala värden. Cirklar visar medelvärdet. C CGC membranresistens var inte annorlunda mellan betingelser. d representativa spår av CGC-aktivitet från aversivt betingade och naiva djur. det fanns ingen signifikant skillnad i membranpotential mellan de två tillstånden (n = 12 för båda). f Membranresistens var inte signifikant olika mellan förhållandena. g värme tomter av normaliserad PlB-aktivitet som svar på aversiv konditionerad stimulans (CS) i preparat från aversivt utbildade och naiva djur., Data organiserad från hög till låg PlB-aktivitet efter den konditionerade stimulansen. Vit linje representerar början på konditionerad stimulans. h representativa spår och normaliserad linje plot av PlB spike frekvens som svar på den aversiva betingad stimulans. Linje och skuggning visar medelvärde ± standardfel för medelvärdet. jag värmer tomter av normaliserad PlB-aktivitet som svar på aptitretande konditionerad stimulans i preparat från aptitretande utbildade och naiva djur. j representativa spår och normaliserad linje plot av PlB spike frekvens som svar på aptitretande betingad stimulans., Förkortningar: appet, appetitive; avers, aversive; tr, training; MP, membranpotential; norm, normalized; prep, preparation
Vi försökte nästa identifiera förändringar som induceras av aversiv konditionering. Eftersom det konditionerade svaret var en minskning av utfodring, motiverade vi att det kan bero på en förbättrad hämmande effekt som härrör från defensiv-uttagskretsen., En kandidatneuron för detta är PlB interneuron30 som förbinder uttags-och matningskretsarna och dess aktivering av aversiva stimuli är tillräcklig för att hämma matning31. I isolerade hjärnpreparat från aversivt konditionerade djur orsakade en in vitro-analog av den konditionerade stimulansen (se metoder) en signifikant ökning av PlB-bränningshastigheten jämfört med naiva kontroller (Mann Whitney test, p = 0,029, U = 106) (Fig. 2g, h), samt ett lägre uttryck för fiktiva matningscykler (ett in vitro korrelat av det konditionerade svaret) (kompletterande Fig. 4c, d)., PlB-bränningshastigheter före den konditionerade stimulansen var inte signifikant olika mellan förhållandena (oparade t-test, p = 0,94, t = 0,08, DF = 36). CGC-svar på den konditionerade stimulansen visade ingen förändring efter aversiv konditionering (kompletterande Fig. 4e). Vi testade om PlB-aktivitet ändrades efter aptitretande konditionering men fann ingen förändring i PlB-bränningshastigheter som svar på den aptitretande konditionerade stimulansen (Mann Whitney test, P = 0.39, U = 56.5) eller i dess bränningshastigheter före den konditionerade stimulansen (oparade t-test, p = 0.38, t = 0.89, DF = 22) (Fig. 2i, j)., Preparat som härrör från appetitivt betingade djur visade dock fortfarande ett större fiktivt utfodringssvar på gamma-nonalakton jämfört med naiva kontroller (kompletterande Fig. 4f, g). Dessa resultat visar att aversivt lärande orsakar en ökning av en hämmande väg, som skiljer sig från de neurala förändringar som ligger till grund för aptitretande minnen. Sammantaget tyder dessa resultat på att konkurrensen inom samma minneskrets är en begränsande faktor i djurens förmåga att konsolidera flera liknande minnen., Sådan konkurrens påverkar inte konsolideringen av olika minnen som är beroende av olika kretsmekanismer, vilket står för bristen på proaktiv störning av de aptitretande och aversiva minnena vid non-lapse-punkten.
retroaktiv interferens kräver nytt lärande i allmänhet
Vi försökte därefter dissekera vilken aspekt av den andra träningen som var ansvarig för retroaktiv interferens vid bortfallspunkter., Vi testade om induktionen av ett andra associativt minne var nödvändigt för att blockera det första minnet eller om presentationen av de konditionerade och okonditionerade stimuli under den andra träningen var tillräcklig för att fungera som en minnesstörare. För att testa detta utförde vi bakåtpresentation av den okonditionerade stimulansen + konditionerad stimulans (kallad BW) (Fig. 3a), som inte resulterade i långtidsminnet med antingen aptitretande (Mann Whitney test, P = 0,07, U = 172,5) eller aversiva protokoll (Mann Whitney test, p = 0,67, U = 174,5) (Fig., 3B, c), bekräftar att BW paradigmer inte inducerar associativt minne. Därefter utförde vi antingen appetitive eller aversiv BW–konditionering vid en lapse punkt i det första minnet och fann att varken hade någon effekt på uttrycket av det första minnet (appetitive BW: Kruskal-Wallis test, P = 0.0043, H = 10.88; Dunns test, BW vid 2 h vs naïve p < 0.05 och första träningen ensam vs naïve p < 0, 01. Aversiv BW: Kruskal-Wallis test, P = 0,001, H = 13,81; Dunns test, BW vid 2 h vs naiv p < 0.,05, första träningen ensam vs naiv p < 0,001) (Fig. 3d–G). Dessa resultat tyder på att induktionen av ett andra associativt minne är nödvändigt för retroaktiv störning av det första minnet.
förvärvet av nytt minne krävs för retroaktiv störning. en tidslinje av bakåtkonditionering (BW) paradigm., B BW-presentation av sackaros och amylacetat (AA) framkallar inte ett signifikant större svar på den konditionerade stimulansen (CS) jämfört med naiva kontroller när de testas vid 24 h (BW: n = 24, naiva: n = 21). Violin tomter visar tätheten av data som sträcker sig från lägsta till högsta värden. Interna boxplots visar median och interquartile intervall (första och tredje kvartilen). Whiskers representerar minimala till maximala värden. Cirklar visar medelvärdet. C BW-presentation av kinin och L-serin (L-s) inducerar inte ett aversivt minne (BW: n = 19, naiv: n = 20)., d tidslinje av BW med sackaros och amylacetat under det första appetitiva minnet (gamma-nonalakton (GNL) parat med sackaros). e BW under förfallodagen påverkade inte långtidsminnet jämfört med naiva kontroller (2 h: n = 22, första träningen ensam: n = 21, naiv: n = 24). f tidslinje av BW med kinin och L-serin under förfallet av det första appetitiva minnet (gamma-nonalakton parat med sackaros)., g BW under förfallodagen påverkade inte långtidsminnet jämfört med naiva kontroller (2 h: n = 20, första träningen ensam: n = 20, naiv: n = 20)
detta väckte frågan om det är specifikt nytt associativt lärande eller nytt lärande i allmänhet som kan orsaka retroaktiv störning. För att ta itu med detta använde vi ett icke-associativt paradigm som den andra träningen. Vi visade att stark taktil stimulering av huvudet leder till en sensibiliserad tillbakadragande svar på en kort ”light off” stimulans (Fig. 4a)., Denna korta stimulans utlöste inte ett återtagssvar hos naiva djur (upprepade åtgärder ANOVA, p = 0,62 (f (3,42) = 16,58)) (Fig. 4a). Däremot visade djur som utsattes för stark taktil stimulering 10 min före”light off”-stimulansen ett signifikant återtagssvar (upprepade åtgärder ANOVA, p < 0.001 (f(3,42) = 0.54), Dunnetts test: före vs 5 s p < 0.001, före vs 10 s p < 0.001, före vs 20 s p iv id= ”s p> 0,05) (Fig. 4a)., Således orsakar stark taktil stimulering av huvudet sensibilisering, en form av icke-associativt lärande.
ny icke-associativ inlärning är tillräcklig för retroaktiv interferens. en taktil stimulering av huvudet inducerar kortvarig sensibilisering. 10 min efter taktil stimulering presenterades en kort ljusstimulans för djuret (infogad bild) och deras återtagsrespons uppmätt., Djur visade en signifikant ökning av tillbakadragandet svar på ljuset av stimulans, som varade i 10 s Efter stimulans (vänster bild, före stimulans; rätt bild, efter stimulans) (n = 15). Naiva djur visade ingen signifikant tillbakadragande svar på samma stimulans (n = 15). Data visar medelvärde ± standardfel för medelvärdet. b tidslinje för applicering av sensibiliserande stimulering efter aptitretande konditionering., C Sensibilisering under förfallet, men inte under non-lapse, stör avsevärt djurets minne för den konditionerade stimulansen (CS), gamma-nonalakton (GNL), när den testas vid 24 h (första träningen ensam: n = 29, 2 h: n = 19, 1 h: n = 22, naiv: n = 29). Violin tomter visar tätheten av data som sträcker sig från lägsta till högsta värden. Interna boxplots visar median och interquartile intervall (första och tredje kvartilen). Whiskers representerar minimala till maximala värden., Cirklar visar medelvärdet
därefter tillämpade vi sensibiliserande stimulering vid förfallodagen för det aptitretande minnet (Fig. 4b). Vi visade att det retroaktivt störde det associativa minnet, medan när det applicerades vid non-lapse-punkten var minnet unimpaired (One-way ANOVA, p < 0.001 (f(3,78) = 7.191), Bonferroni test: first training alone vs naïve p < 0.001, 1 h vs naïve p < 0,01, 2 h vs naiv p > 0,05) (fig. 4c)., Därför stör förvärvet av antingen ett associativt eller icke-associativt minne under förfalloperioden retroaktivt det ursprungliga associativa minnet.
retroaktiv störning stör minneskonsolidering
Vi testade nästa om den uppenbara ersättningen av det första minnet med det andra berodde på retroaktiv störning som stör konsolideringen av det ursprungliga minnet eller på att dess uttryck undertrycks av det andra minnet. Om det första minnet inte kunde återställas genom att blockera den andra, skulle detta indikera att konsolideringen stördes., Men om det kunde återställas, skulle detta indikera att uttrycket av det första minnesspåret aktivt undertrycks av det befintliga andra minnet. För att testa detta utfördes andra aptitretande träning 2 h efter den första aptitretande träningen för att störa det första minnet. Sensibiliserande stimulering applicerades sedan 2 h senare, vid ett tillfälle i konsolideringen av det andra lärandet (Fig. 5A) för att blockera det andra minnet (Fig. 5b)., Detta säkerställde att den sensibiliserande stimuleringen inträffade vid ett bortfall av det andra minnet (2 h) men en icke-bortfallspunkt för det första minnet (4 h) (kompletterande Fig. 5A, B visar att den sensibiliserande stimuleringen är tillräcklig för att blockera det andra aptitretande minnet). Applicering av den sensibiliserande stimuleringen ensam 4 h efter den första aptitretande träningen har ingen effekt på det första minnet (kompletterande Fig. 5c, d). Även om detta paradigm lyckades blockera det andra minnet, återställdes inte uttrycket av det första minnet vid 24 h (Fig. 5B, gamma-nonalakton)., Däremot, när Ingen sensibiliserande stimulering applicerades, var det den förväntade störningen av det första minnet och förvärvet av den andra (amylacetat testade djur: One-way ANOVA, p < 0.001 (f(2,73) = 21.11), Bonferroni test: ingen sensibilisering vs naïve p < 0.001, ingen sensibilisering vs sensibilisering p < 0.001, sensibilisering vs naiv p > 0.05. Gamma-nonalactone testade djur: enkelriktad ANOVA, p = 0,33 (f (2,64) = 1,12)) (Fig. 5b).
blockering av det andra minnet leder inte till återvinning av det första minnet. en tidslinje av experiment. Djuren fick den första träningen följt av den andra träningen under 2 h-tiden. Sensibiliserande stimulering applicerades 2 h efter den andra träningen (4 h efter den första träningen). Djuren testades sedan för sitt svar på antingen betingad stimulans (CS), gamma-nonalakton (GNL) eller amylacetat (AA), vid 24 h., B Sensibilisering var tillräcklig för att blockera det andra minnet, medan inga sensibiliserande stimuli resulterade i ett starkt andra minne jämfört med naiva kontroller (sensibilisering: n = 22, ingen sensibilisering efter andra träning: n = 24, naiv: n = 30). Det fanns inget ökat svar på gamma-nonalakton utöver naiva nivåer vid 24 h Trots blockeringen av det andra minnet., Djur som fick den andra träningen utan sensibilisering hade inte heller ett signifikant annorlunda svar på gamma-nonalakton jämfört med naiva kontroller (sensibilisering: n = 22, ingen sensibilisering efter andra träning: n = 18, naiv: n = 27). Violin tomter visar tätheten av data som sträcker sig från lägsta till högsta värden. Interna boxplots visar median och interquartile intervall (första och tredje kvartilen). Whiskers representerar minimala till maximala värden. Cirklar visar medelvärdet. c tidslinje för injektion av anisomycin (ANI) efter den andra aptitretande träningen., d ani blockerade konsolideringen av det andra minnet, medan saltinjektion resulterade i ett starkt andra minne (ANI: n = 20, saltlösning: n = 20, naiv: n = 22). ANI efter den andra träningen återställde inte det första minnet när det testades vid 24 h (ANI: n = 20, saline: n = 20, naiv: n = 20)
användningen av sensibiliseringsprotokollet gjorde det möjligt för oss att dra slutsatsen att när det andra minnet blockerades vid dess 2 h-lapse-punkt, återuppstod det första minnet inte., Men eftersom blockeringen av det andra minnet med sensibilisering endast kunde utföras framgångsrikt vid minnestiden 2 h efter den andra träningen och vi visste bara att det raderade det andra minnet när det testades vid 24 h, behövde vi en annan metod som snabbt blockerar minnesbildning och leder till radering av det andra minnet i ett tidigt skede. En sådan metod skulle fastställa om blockeringen av endast de tidigaste processerna för konsolideringen av det andra minnet skulle rädda det första minnet., Vi använde därför farmakologiska metoder för att blockera den tidiga konsolideringen av det andra minnet. Behandling med translationell hämmare anisomycin (ANI) snabbt block för syntes av nya proteiner i Lymnaea brain32 och dess post-utbildning ansökan hindrar uttryck av minne från så tidigt som 1 h efter conditioning19 liksom dess ytterligare konsolidering i långsiktiga memory32. Djur injicerades med Ani eller saltlösning 10 min efter den andra appetitive träningen (2 h 10 min efter första appetitive träning) och testades för långtidsminne (Fig. 5c)., Ani injektion ensam vid 2 h 10 min hade ingen effekt på uttrycket av det första minnet (kompletterande Fig. 5e, f) men det hade framgångsrikt blockerat det andra minnet (Fig. 5d). Men detta tidiga ingripande misslyckades med att rädda det första minnet (Fig. 5d), vilket indikerar att det verkligen stördes av det andra minnet inom en timme efter den andra träningen. Saline injicerade djur visade den förväntade minnesstörningen (amylacetat testade djur: One-way ANOVA, p < 0.001 (f(2,59) = 11.09), Bonferroni test: saline vs naïve p< 0.,001, ANI vs saline p < 0,01, ANI vs naive p > 0,05. Gamma-nonalactone testade djur: enkelriktad ANOVA, p = 0,75 (f (2,57) = 0,295)) (Fig. 5d). Dessa experiment tyder på att retroaktiv störning sker inom ett tidigt tidsfönster efter förvärvet av det andra minnet. Vi drar slutsatsen att blockering av det andra minnet inte leder till uttrycket av ett ”undertryckt” första minnesspår. Dessa experiment stöder därför slutsatsen att det andra minnet, åtminstone på beteendenivå, effektivt ersätter det första minnet.