Observation
mycket av framstegen i mikrobiologi har berott på studien av ”rena kulturer.”Det här är kulturer som bara innehåller en typ av cell, helst med kulturen härrörande från en initial enda cell., Från den tidiga utvecklingen av metoder för att upprätta rena kulturer (1) har det funnits många exempel där kulturer som ursprungligen ansågs vara rena senare befanns innehålla två typer av mikrober. I vissa fall har dessa oavsiktliga multispeciekulturer lett till viktiga genombrott, t.ex. upptäckten av överföring av väte mellan arter (2). Men med tillkomsten av djup sekvenseringsteknik kan det rimligen förutses att oupptäckta föroreningar i kulturer inte längre skulle vara ett betydande problem.,
Geobacter sulfurreducens stam PCA isolerades i mitten av 1990-talet genom att använda standard anrikning och isoleringsteknik som inkluderade utspädning till utrotning i flytande medium, följt av upprepad strimning av isolerade kolonier på agar-stelnat medium (3). Detta är den klassiska strategin som lärs ut i de mest populära inledande mikrobiologiska läroböckerna (4-6). Senare, G. sulfurreducens stam DL1 erhölls av en extra restreaking av isolerade PCA kolonier (7). Med utvecklingen av metoder för genetisk manipulation av G. sulfurreducens (7) och sekvenseringen av dess genom (8), G., sulfurreducenser blev de Geobacter-arter som valts för studier av fysiologi och nya extracellulära elektronöverföringsegenskaper hos detta miljömässigt viktiga Släkte (9). Initial sekvensering av 16S rRNA-genen i kulturen (3), liksom sekvensering av genomet först till 8-faldigt (8) och sedan till 80-faldigt (10, 11) täckning, indikerade att kulturen innehöll endast en stam.,
i ett försök att anpassa DL1 för att producera mer ström, inokulerades det till ett bioelektriskt system med en grafitanod som är redo för en potential (-400 MV mot Ag/AgCl) som anses vara nära den nedre gräns vid vilken nuvarande generation från acetat skulle vara möjlig (12). Ett isolat som erhållits från anoden biofilm, betecknad G., sulfurreducens stam KN400 (12), är överlägsen inokulatstammen för att producera elektrisk ström, och denna överlägsenhet tillskrivs åtminstone delvis dess förmåga att producera mer ”mikrobiella nanotrådar”, elektriskt ledande proteinfilament som uppvisar metallisk liknande elektrisk ledningsförmåga (13, 14).
det antogs ursprungligen att Stam KN400 hade ackumulerat en eller flera mutationer som förbättrade sin kapacitet för extracellulär elektronöverföring., Detta skulle vara analogt med valet av muterade stammar under adaptiv utveckling av stam DL1 för elektronutbyte med andra organismer (11) eller högre nivåer av FE(III) oxidreduktion (10). Jämförande genomik visade emellertid att genomsekvensen av stam KN400 innehöll mer än 27,270 enkla nukleotidpolymorfismer (SNPs) (15). En tredjedel av generna hade minst en nukleotidpolymorfism, och en fjärdedel hade en polymorfism som påverkade den resulterande proteinsekvensen (15). Baserat på typiska mutationshastigheter på 6.,3 × 10-9 / bp per generation (16), det skulle ta mer än 1000 år att ackumulera dessa många mutationer i stam DL1. Dessutom finns det inga ortologer i DL1-stammen för 139 av de öppna läsramarna (ORFs) i KN400-stamgenomet, varav de flesta är närmast relaterade till gener i fylogenetiskt olika organismer (15).
dessa överväganden och det faktum att ORFs unique to KN400 inte detekterades när inokulatkulturen ombildades (10, 11) ledde till hypotesen att KN400 kom in i det bioelektrokemiska systemet som en förorening., För att utvärdera denna möjlighet bedömdes renheten hos DL1-kulturen ytterligare med ännu högre känslighet.
Både DL1 och KN400 innehåller omcS, en gen för en yttre yta cytokrom som har en av de högsta andelarna av Snp (36 Snp/kb) mellan två stammar (15). Denna gen förstärktes från DL1-kulturen som hade använts för att inokulera det bioelektrokemiska systemet, och PCR-produkterna sekvenserades med Illumina Hi-Seq 2000 (se Text S1 i det kompletterande materialet)., KN400-sekvensen detekterades, vilket indikerar att KN400 var närvarande i det ursprungliga inokulatet som användes för anodvalsstudien. Av>107 återhämtade sig högkvalitativa sekvenser, endast 286 var KN400-sekvenser mot 1.5 × 107 DL1-sekvenser (Tabell 1).
Sms: a S1
Material och metoder: en, upptäckt av omcS sekvenser genom sekvensering, b, qPCR, c, strimma bordläggningen och utspädning till utrotning; d, tillväxt kurva och coculturing av stammar DL1 och KN400, e, tillväxt på ett negativt redo anod. Ladda ner Text S1, PDF-fil, 0.1 MB.,
Copyright © 2013 Shrestha et al.
det här är en Open-access-artikel som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, som tillåter obegränsad icke-kommersiell användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.,
- Visa inline
- visa popup
uppskattningar av stam KN400 överflöd i olika culturesa
tabell S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
detta är en Open-access-artikel som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Oporterad licens, som tillåter obegränsad icke-kommersiell användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.
den relativa förekomsten av KN400-stammen i samma kultur utvärderades ytterligare av kvantitativ PCR (qPCR) med en primeruppsättning som är specifik för en gen som endast finns i KN400 (se Text S1 och tabell S1 i det kompletterande materialet) och en primeruppsättning som detekterade både KN400 och DL1 (Se tabell S1 i det kompletterande materialet)., Den relativa överflöd av KN400 – specifik sekvens var liknande den för KN400 omcS sekvenser som bestäms av sekvenseringsmetoden (Tabell 1). Sekvensanalys och qPCR-analys av PCA-kulturen deponerad vid ATCC avslöjade närvaron av KN400 vid en liknande låg överflöd (Tabell 1).
vi försökte ta bort den sällsynta KN400-föroreningen från DL1-kulturen genom upprepad restreaking av isolerade kolonier odlade på stelnat acetatfumaratmedium (7), men KN400-stammen fortsatte att kvarstå vid en låg frekvens i de isolerade kolonierna (Tabell 1)., En odling där KN400 inte längre kunde detekteras erhölls emellertid i flytande acetatfumaratmedium (se Text S1 i det kompletterande materialet) där den högsta utspädningen som uppvisade tillväxt utsattes för flera på varandra följande omgångar av serieutspädning (Tabell 1). Detta visade att DL1-stammen inte kräver den sällsynta närvaron av KN400 för att växa i acetatfumaratmediet där denna kultur rutinmässigt upprätthålls.
När ren KN400 och KN400-gratis DL1 kultur inympats i acetat-fumarat medium i lika stora mängder, DL1 outcompeted KN400 (Fig., 1a). Detta är förenligt med att hitta att när de två stammar som odlas separat, DL1 växte mycket snabbare än KN400 (optisk densitet vid 600 nm på 0,04 för KN400 kontra 0.65 för DL1 efter 36 h inkubation, se Fig. S2 i det kompletterande materialet) i samma medium. Andelen KN400 fortsatte att minska med varandra följande överföringar (1% inoculum) tills överflöd av KN400 var jämförbar med den i PARTNERSKAPS-och samarbetsavtalet och DL1 lager kulturer (se Text S1 i det kompletterande material). KN400 fortsatte på denna låga nivå med ytterligare överföringar (Fig. 1a).,
Figur S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
det här är en Open-access-artikel som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, som tillåter obegränsad icke-kommersiell användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.,
tillväxt och aktivitet av stam KN400 under olika tillväxtförhållanden. a) relativ förekomst av KN400 i successiva mellanloggsöverföringar (1% inokulat) av en kultur som initierats med lika proportioner KN400 och DL1. Resultaten är medel och standardavvikelser för tredubbla kulturer. b) nuvarande produktion när DL1-kulturen introducerades i anodkammaren i ett bioelektrokemiskt system med en grafitanod som är redo vid -400 MV jämfört med Ag/AgCl. KN400-fria kulturen producerade ingen ström under denna tid., (C) relativ överflöd av KN400 i anod biofilmer när det ursprungliga inokulatet var DL1-kulturen som senare befanns innehålla KN400. Resultaten är medel och standardavvikelser för tredubbla kulturer.
upprepade försök att odla KN400-fri DL1-kulturen på en anod som är redo för -400 MV misslyckades. Ström producerades emellertid lätt i en annan uppsättning experiment där DL1-kulturen innehållande KN400 fungerade som inokulat (Fig. 1b)., En qPCR-analys av DNA som extraherats från anoden biofilm visade att 100% av omcS sekvenser var KN400 inom den andra överföringen (Fig. 1c). Dessa resultat föreslog att anledningen till att KN400 uppstod på anoderna var att DL1-stammen inte kunde växa under de villkor som infördes. Utan detta ovanliga selektiva tryck skulle KN400 ha förblivit oupptäckt i PCA-och DL1-kulturerna även genom för närvarande tillgängliga nästa generations sekvenseringsmetoder som teoretiskt kan ge tusenfaldig täckning i genomsekvensering.,
de faktorer som bidrar till den långsiktiga persistensen av stam KN400 vid extremt låg frekvens i DL1-kulturen är fortfarande ett mysterium. Betydelsen av att fysiskt isolera enskilda celler med metoder som är mer definitiva än strimmor på fast medium för att etablera rena kulturer har erkänts under en tid (17), och alltmer sofistikerade metoder för att uppnå detta fortsätter att utvecklas (18-23)., De pläteringsmetoder som har använts i mer än 100 år och lärs till varje mikrobiologistudent som standardprocedurer för att erhålla rena kulturer (4-6) är dock de vanligaste. De resultat som presenteras här visar att utan encellsisolering kan kryptiska föroreningar överleva vid mycket låg frekvens i kulturer under årtionden av intensiv undersökning och kan undkomma upptäckt genom även de mest sofistikerade sekvenseringsmetoder som för närvarande finns tillgängliga.,
Figur S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
det här är en Open-access-artikel som distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported license, som tillåter obegränsad icke-kommersiell användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.,