3.1.2.2. HPLC
HPLC med hjälp av acetonitril-eller hexanbaserade mobila faser möjliggör direkt detektion av fosfolipider utan föregående rensning av det råa extraktet, vilket gör dessa metoder enkla och snabba. Dessa metoder skiljer emellertid inte effektivt de olika inositolfosfolipiderna. Nakamura et al. (1989) har utvecklat en HPLC-förfarande som specifikt analyserar PtdIns och PtdInsP2 i hjärnan., I denna metod, lipidextrakt är första derivatized med 9-anthryldiazomethane att producera (9-anthryl) PtdInsP och di(9-anthryl) PtdInsP2 och då derivatized provet separeras med HPLC med UV-detektion vid 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn och SM är inte derivatized med denna reagens och därför inte kan interferera med analysen (Yamada et al., 1988). Denna metod är känsligare än den underivatiserade UV-detektionsmetoden för analys av inositolfosfolipiderna.
Low (1990) har beskrivit användningen av deae-cellulosakolumner för preparativ HPLC av hjärnlipider., Hjärnfosfolipiderna lösta i 50 ml lösningsmedel a (kloroform / metanol / H2O, 20: 9: 1, vol.) och appliceras på cellulosa kolonnen (deae cellulosa, Sigma), som tvättas med alkali och syra till neutralitet. Den tvättade deae-cellulosan packas i en glaskolonn (2 cm × 38 cm) med lösningsmedelsresistenta beslag. Kolonnen elueras sedan med en flödeshastighet av 100 ml / h med 1 1 linjär gradient från 100% lösningsmedel A till 100% lösningsmedel B (lösningsmedel a innehållande 0,6 m ammoniumacetat) och 13-15 ml fraktioner uppsamlas och analyseras för fosfor (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolering av PtdInsPs från bovin hjärnan genom en DEAE-cellulosa kolonn kromatografi. Syratvättad metanol-utfälld Folkfraktion eluerades från en DEAE-cellulosakolonn med en gradient av 100% lösningsmedel a (kloroform / mefhanol / H2O, 20: 9: 1, vol.) till 100% lösningsmedel B (lösningsmedel a innehållande 0,6 m ammoniumacetat) och 13-15 ml fraktioner uppsamlade. Fraktionerna analyserades för organisk fosfor. Den genomsnittliga återvinningen av tillämpad organisk fosfor var cirka 90%., Topp eluering vid bråktal. Tjugofem var reproduktivt närvarande men identifierades inte. Sammansättningen av topparna bestämdes genom TLC-analys av poolade fraktioner. Toppar identifieras som visas i figuren.
reproduceras från Low (1990) med tillstånd av publisher.
alternativt utförde Low (1990) det kromatografiska steget genom att förbereda HPLC med en aminokolonn. Hjärnfosfolipiderna löstes i 5 ml lösningsmedel A och applicerades med en flödeshastighet av 2.,5 ml/min till en 10 mm × 250 mm amino – NP-kolonn (5 µm sfärisk kiseldioxid med n-propylaminbindad fas, IBM Instruments, Danbury, CT) med en 4,5 mm × 50 mm skyddspelare jämvikt med lösningsmedel A. kolonnen elueras med en flödeshastighet av 2,5 ml/min med 25 ml lösningsmedel A, en 125 ml gradient av 100% lösningsmedel A till 100% lösningsmedel B och 100 ml av 100% lösningsmedel B; 5 ml fraktioner uppsamlas. De poolade fraktionerna koncentreras genom att justera till 18 ml med lösningsmedel A och de fosfolipider som extraheras. Den genomsnittliga återhämtningen av organisk fosfor är 80%., En fullständig separation av Ptdiner (90 ml), PtdInsP (150 ml) och PtdInsP2 (160-200 ml) erhölls (kromatogram visas inte). PtdIns överlappar dock med PtdSer. Sammansättningen av topparna bestämdes med TLC av poolade fraktioner.
låg (1990) har också beskrivit en HPLC-rening av de märkta PtdIns(4)p och PtdIns(4,5)P2 från humana blodplättar. Lipidextraktet från blodplättar framställdes från 60 ml färskt humant blod i närvaro av metanol utfällt bovint hjärnan PtdInsPs som bärare, är slutligen återupplöst i 0.,5 1 av lösningsmedlet A och anbringas med en flödeshastighet av 1 ml / min till en amino-NP-kolonn på 4,5 mm × 250 mm jämvikt i lösningsmedel A. kolonnen elueras med 5 ml lösningsmedel A (en linjär gradient på 25 ml från 100% lösningsmedel A till 100% lösningsmedel B) och 20 ml lösningsmedel B. En milliliterfraktion uppsamlas och radioaktivitet bestäms genom vätskescintillationsräkning. Genomsnittlig återhämtning av tillämpad radioaktivitet är cirka 70%. Det finns en utmärkt upplösning av de tre inositolfosfatiderna men Ptdinerna överlappar med PtdOH., Därför är detta HPLC-förfarande inte lämpligt för framställning av Ptdiner eftersom PtdOH, som i de flesta celltyper är snabbare märkt av Pi, inte löses från den. Det är troligt att andra anjoniska fosfolipider som PtdSer kommer att lösas dåligt från Ptdiner av amino-NP-kolonnen, som observerats med deae-cellulosaproceduren.
som diskuterats ovan är ingen av ovanstående metoder effektiv för att separera de enskilda Ptdinspsna i ren form från råvävnadsextrakt. Därför måste lipidextrakten behandlas av flera kromatografiska steg., För detta ändamål utsätts extraktet först för Sephadex-kromatografi för separation av lipiderna från nonlipiderna i extraktet. Lipidfraktionen hälls sedan på en DEAE-kolonn som elueras med olika lösningsmedel. Ptdinspsna återvinns genom eluering med kloroform / metanol / ammoniumsalt som sista elueringssteget. De enskilda fraktionerna koncentreras till 100 µl vid 45 ° C under kväve och sedan separeras den koncentrerade återstoden ytterligare med patronkolonnskromatografi, TLC, HPLC eller andra kromatografiska förfaranden.,
Singh (1992)har beskrivit utvinning och analys av PtdIns, PtdIns(4)p och PtdIns(4,5) P2 med en Sep-Pak-patron. Totalt lipidextrakt (Folch et al., 1957) av råtthjärnsynaptosomer och mikrokärl bereddes först och den första fraktionen genererades (fraktion 1) samlades in och vidare extraherades till separata fosfolipider och glykolipider enligt beskrivning av Dugan et al. (1986). Fosfolipidfraktionen utsattes för deae-cellulosakromatografi (separationssekvens 4) enligt beskrivningen av Rouser et al. (1969) för att rena ytterligare inositollipiderna., Det renade extraktet överfördes till en Sep-Pak-patron. Olika inositollipider elueras från kolonnen med en linjär gradient av ammoniumacetat och vatten från 0,5% ammoniumacetat (200 mM) och 99,5% vatten till 75% ammoniumacetat och 25% vatten i 60 min med en flödeshastighet av 0,5 ml/min (se kapitel 2). Kolonneluatet för 120 min samlades i 1 ml fraktioner. Olika toppar identifierades genom att använda PtdIns, PtdIns(4)p och PtdIns(4,5)P2 toppar som referenspunkter., Fraktionerna som innehåller enskilda inositollipider poolades och analyserades av HPLC som beskrivet av Geurts van Kessel et al. (1977). Individuella fosfolipider detekterades vid 206 nm genom att använda en diod matrisdetektor programmerad för att skanna ett 200-350 nm-område. Singh (1992) har visat 50-90% återhämtning av Ptdiner och InsPs från hjärnprover. InsP3 och InsP4 visade den lägsta återhämtningen på grund av dålig kvantifiering snarare än en dålig utvinningsmetod. Patronmetoderna har inte tillämpats för isolering av PtdIns (3)p, PtdIns(3,4)P2 och PtdIns (3,4,5) P3.
Cronholm m.fl., (1992) har beskrivit isoleringen av PtdInsPs från råttpankreas. Varje bukspottkörtel homogeniserades omedelbart i 3 ml kloroform / metanol(1:2, v/v) och ca 3 MBq av 3h-märkta Ptdiner(4)p eller Ptdiner (4,5)P2 tillsattes tillsammans med 0,6 ml 1,2 aq. HCl före extraktion med kloroform, enligt beskrivningen av Schacht (1981). Metanol tillsattes till de poolade och tvättade extrakten för att ge kloroform / metanol (3:2, v/v). Lösningen applicerades på Lipidex-deae-kolonnen, och de flesta lipiderna eluerades med kloroform/metanol (3:2, v/v) eller kloroform/metanol/vatten (3:6:1 vol.)., PtdIns och PtdSer eluerades tillsammans med 0,03 m H3PO4 och oidentifierat material med 0,1 m H3PO4. PtdIns(4)P eluerades med 0,25 m H3PO4 och PtdIns (4,5)P2 med 0,5 m H3PO4 som indikeras av den eluerade radioaktiviteten. Alla fraktioner extraherades med 0,4 ml vatten / ml eluat. Den övre fasen var tillbaka-extraherad med 0,1 vol. kloroform. De sammanslagna kloroformfaserna tvättades med 0,4 vol. 0,5 M HCl 50% aq. metanol. Fraktionerna användes för bestämning av molekylära arter av FAB / MS (se nedan).
Gunnarsson m.fl., (1997) använde normal fas HPLC med förångande ljusspridningsdetektering för analys av kommersiella prover av PtdInsPs tillsammans med andra fosfolipider. Med en linjär gradient av A, kloroform / metanol / ammoniak (50: 45: 3, vol.) och B, kloroform / metanol / vatten / ammoniak (25: 55: 17: 3, vol.) väl löst sena framväxande Toppar för PtdIns(4)p och PtdIns (4,5)P2 erhålls. Dosresponskurvorna för Ptdiner (4)p och Ptdiner(4,5) P2 var inte linjära, vilket är en egenskap hos ljusspridningsdetektorn (resultaten visas inte)., För de flesta ändamål är HPLC-tekniken överlägsen i upplösning, hastighet och övergripande bekvämlighet till deae-cellulosaproceduren och är den metod som väljs om HPLC-utrustning finns tillgänglig. Deae-cellulosa är billig och storskalig rening kan kräva användning av detta material. HPLC-förfarandet är också överlägset vissa eller i alla avseenden alternativa förfaranden för rening av polyfosfoinositider, t.ex. preparativ TLC eller neomycinaffinitetskromatografi.