i April i år, vi bevittnade en av de mest monumentala landvinningar i biologi: den fullständiga sekvensering av det mänskliga genomet. Avkodning och databasavsättning av miljarder baser av sekvens är utgångspunkten för postsequence funktionella genomik. Upptäckten av det periodiska systemet hade en viktig inverkan på kemi., Även den fullständiga dechiffreringen av det mänskliga genomet kommer att ha imponerande effekter på människors hälsa och livskvalitet. För närvarande förstår vi funktionen av endast ett begränsat antal mänskliga gener. Att studera alla mänskliga gener funktion är en teknisk utmaning. För att möta denna utmaning har nya hög genomströmningsverktyg utvecklats. Microarray-analysen är en kraftfull molekylär teknik som möjliggör samtidig studie av uttrycket av tusentals gener eller deras RNA-produkter, vilket ger en korrekt bild av genuttryck i cellen eller provet vid tidpunkten för studien.,
till exempel kan uttrycket av alla gener för läkemedelsresistens och metabolism eller alla kända onkogener i en cell detekteras och mätas inom samma tidsram (Brown och Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Mikroarrayen kan definieras som en beställd samling mikrospots (sonderna), varje plats som innehåller en enda art av en nukleinsyra och representerar generna av intresse. Denna teknik är baserad på hybridisering mellan märkta fria mål som härrör från ett biologiskt prov och en rad många DNA-sonder som immobiliseras på en matris (Southern et al.,, 1999). Målen produceras genom omvänd transkription och samtidig märkning av RNA-extrakt från ett biologiskt prov hybridiserat med DNA-fragmentsonder. Hybridiseringssignalen som produceras på varje sond är mRNA-uttrycksnivån för motsvarande gen i provet vid tidpunkten för studien. Signalerna detekteras, kvantifieras, integreras och normaliseras med dedikerad programvara och återspeglar ”genuttrycksprofilen” eller ”molekylärporträtt” för varje biologiskt prov.,
tusentals eller tiotusentals olika fläckar kan skrivas ut på en kisel-eller glasskiva eller en nylon solid state-bas. Det finns huvudsakligen två varianter av mikroarrays: cDNA och oligonukleotidmikroarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart m.fl., 1996). Även om båda typerna av mikroarray används för att analysera genuttryck mönster, dessa varianter är fundamentalt olika (Lipshutz et al., 1999). I cDNA mikroarrays immobiliseras relativt långa DNA-molekyler på en fast yta. Denna typ av mikroarray används oftast för storskaliga screening-och expressionsstudier., Oligonukleotidmikroarrayen tillverkas av in situ ljusstyrd kemisk syntes eller genom konventionell syntes följt av immobilisering på en glasmatris. Denna mikroarray används för detektering av mutationer, genkartläggning och expressionsstudier och möjliggör differentialdetektering av genfamiljer eller alternativa transkript som inte kan särskiljas av cDNA-mikroarrays.
mikroarrays kemi i sig är inte ny, eftersom hybridiseringstekniken har varit väletablerad i årtionden., Den samtidiga studien av tusentals gener omvandlar emellertid mikroarraytekniken till ett kraftfullt hela systemanalysverktyg. Nästan 10 år har gått sedan de första mikroarrayerna skapades, och ändå förbättras och utvecklas denna teknik fortfarande. Sedan den första introduktionen har antalet mikroarrayapplikationer ökat (Figur 1). Med utgångspunkt från deras användning i genscreening och målidentifiering finner denna teknik nya tillämpningar som utvecklingsbiologi, sjukdomsklassificering, pathway-studier, drogupptäckt och toxikologi., Tekniken som är involverad i produktion och användning av mikroarrayen ligger utanför ramen för denna översyn, men har i stor utsträckning granskats på annat håll (Schena et al., 1995; Niemeyer och Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown och Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Cheung m.fl., 1999; Duggan et al., 1999; Gravar, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al., 2000; Meldrum, 2000). Vi beskriver här några av den senaste utvecklingen och resultaten inom mikroarrayteknik inom cancerforskning, diskuterar potentiella problem, beskriver kliniska tillämpningar och kommenterar framtiden för denna teknik.,
antal citat som finns i MEDLINE genom att infoga ’microarray’ (grå bar) eller ’microarray+cancer’ (vit bar) för en PubMed-sökning. Artiklar publicerades mellan 1995 och 2002
vikten av att mäta globalt genuttryck i mänskliga cancerformer
karakterisera populationen av transkriberade gener har lett till skapandet av en ny term, transkriptomet (Su et al., 2002)., Detta koncept definierar den kompletta uppsättningen transkriberade gener uttryckta som budbärare RNA för en viss art. Transkriptom representerar därför universum av RNA-budbärare som kan koda för proteiner. Endast cirka 5% av generna är aktiva i en viss cell vid en given tidpunkt. De flesta generna är förtryckta, och denna kontroll kan förekomma på antingen transkriptional eller translational nivå. Eftersom regleringen av proteinuttryck på transkriptionsnivå är effektivare, sker mest kontroll på denna nivå., En Cells genuttryck profil bestämmer dess funktion, fenotyp och svar på yttre stimuli. Därför kan genuttryck profiler bidra till att belysa cellulära funktioner, biokemiska vägar och regleringsmekanismer. Dessutom kan genuttrycksprofiler av sjukdomsceller / vävnader, jämfört med normala kontroller, främja förståelsen av sjukdomspatologi och identifiera nya terapeutiska interventionspunkter, förbättra diagnosen och klargöra prognosen.,
under de senaste åren har flera genuttryck profileringsmetoder uppstått och har tillämpats framgångsrikt på CancerForskning. Dessa inkluderar differentialdisplay, seriell analys av genuttryck och mikroarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud m.fl., 1999; Cheng et al., 2002). Mikroarrayerna har blivit viktiga eftersom de är lättare att använda, Kräver inte storskalig DNA-sekvensering och tillåter parallell kvantifiering av tusentals gener från flera prover., Genuttryck profilering av cancer representerar den största kategorin av forskning med hjälp av mikroarray teknik och verkar vara den mest omfattande strategi för att karakterisera cancer molekylärt. Även om cancerfenotypen endast delvis bestäms av dess transkriptom, ger den fortfarande en tydlig bild av en Cells fysiologiska tillstånd. Kraften i detta tillvägagångssätt har visats i studier som utförts på en omfattande mängd olika maligniteter, inklusive cancer i bröst, huvud och nacke, lever, lunga, äggstock, bukspottkörtel, prostata och mage (Bhattacharjee et al.,, 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber m.fl., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han m.fl., 2002; Hedenfalk m.fl., 2002; Flodhäst et al., 2002; Luo m.fl., 2002a).,jämfört med dess motsvarande kontrollprov för att mäta skillnaderna och likheterna mellan båda fenotyperna, cancerstratifiering, där genuttrycksprofilerna från olika prover av samma cancertyp jämförs för att avslöja distinkta undergrupper för att bättre definiera molekylär klassificering av en gemensam histologisk typ av cancer och slutligen temporal utvärdering av tumören, där genuttryckmönstren från tumörprover härledda från olika stadier av progression jämförs för att belysa skillnaderna mellan sjukdomens tidiga och avancerade stadier., Även om många studier av mikroarrayanalys i human sjukdom har publicerats, presenterar vi här några av dem som har ett kliniskt intresse för onkologi.
Microarray och prostatacancer
flera studier med microarrays för att karakterisera prostatacancer genuttryck profiler har nyligen publicerats. Dessa studier har använt microarray teknik som en gen upptäckt verktyg för att identifiera genetiska markörer som diskriminerar mellan normala och cancer prostata vävnader., En enkel mikroarray-studie har utförts med hjälp av fläckiga membranmatriser för att analysera normala och cancerösa vävnader och cellinjer (Bull et al., 2001). Membranmikroarrayfynd begränsas av den relativa okänsligheten hos denna teknik för att detektera transkript uttryckta vid låga nivåer och det lilla antalet fläckar som kan placeras på membranen; denna studie har dock givit kandidatmarkörer för prostatacancer för vidare utvärdering., Fem publicerade studier har analyserat genuttryck profiler i flera tusen gener under det normala och prostata vävnader och används oövervakad hierarkisk klustring analys för att sortera prover (Dhanasekaran et al., 2001; Luo m.fl., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) kunde skilja normal prostata, godartad prostatahyperplasi (BPH), lokaliserad prostatacancer och metastatiska prostatacancerprover med 9,984 elementfläckade mikroarrays. Med hjälp av hierarkisk klusteranalys, Luo et al., (2001) kunde diskriminera 16 prostatacancerprover från nio BPH-prover på grundval av skillnader i genuttryck profiler mätt på 6.500 element-spotted cDNA microarrays. Welsh et al. (2001a) rapporterade en liknande sortering av normala och maligna prostatavävnadsprover med oligonukleotidmikroarrays. Intressant nog identifierade alla de fem grupperna transmembranserinproteas hepsin som visar signifikant ökat uttryck i maligna vävnader jämfört med den för normal prostatavävnad (Dhanasekaran et al., 2001; Luo m.fl., 2001, 2002b; Welsh et al.,, 2001a; Singh et al., 2002). Många andra kandidatmarkörer av prostatacancer såsom proto-onkogen PIM1 har kommit fram ur andra studier och undersöks ytterligare som potentiella diagnostiska markörer. Det minskade PIM1-uttrycket på immunohistokemi av prostatatumörprover gav en ökad risk för återfall efter operationen (Dhanasekaran et al., 2001). Andra grupper som använder kombinationer av subtraktiv hybridisering och mikroarrayanalys har identifierat flera potentiella kandidater för prostatacancer immunmodulerande terapi inklusive prostein (Xu et al.,, 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) och p504S/Alfa-Metylacyl-CoA-Racemas (Jiangs et al., 2001). I en mycket ny studie, Virolle et al. (2003) använde en prostatacancercelllinje som uttrycker en hög konstitutiv nivå av Egr1-protein, en transkriptionsfaktor överexponerad i majoriteten av aggressiva tumörframkallande prostatacancerceller. De bedömde Egr1 transkriptionell reglering, genom att utföra en oligonukleotid mikroarrayanalys med hjälp av celler som gjorts bristfälliga i Egr1 som jämförelseprov för identifiering av Egr1-målgener., För första gången i prostatavävnader bekräftade denna studie Tillväxtförstärkarrollen för Egr1 som tidigare observerats i andra cellulära system och identifierade flera nya målgener som specifikt kontrollerar tillväxt, cellcykelprogression och apoptotiska vägar.
mikroarray och oral cancer
hittills har endast ett fåtal mikroarray-studier som är relevanta för oral cancer publicerats. Chang et al. (1998) illustrerade användningen av cDNA microarrays för att karakterisera transformationsrelaterade gener i oral cancer. Villaret et al., använde en kombination av komplementär DNA-subtraktion och mikroarrayanalys för att utvärdera unika gener som är specifika för skivepitelcancer i huvud och nacke (HNSCC) som potentiella tumörmarkörer och vaccinkandidater. Nio kända gener befanns vara signifikant överuttryckta i HNSCC jämfört med normal vävnad. Dessutom överuttrycktes fyra nya gener i en delmängd av tumörer (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001)analyserade transkriptomet i munhålan skivepitelcancer., De fann cirka 600 kandidatgener (onkogener, tumörsuppressorer, transkriptionsfaktorer, differentieringsmarkörer, metastatiska proteiner och xenobiotiska enzymer) som differentiellt uttrycktes i oral cancer och validerade endast tre av dessa gener genom PCR.
Lu et al. (2001) använde mikroarraymetoden för att utvärdera genuttryck profilförändringar under initiering och progression av plavocellkarcinom i matstrupen., De undersökte genuttryck profiler i olika stadier av initiering och progression av esofageal cancer för att identifiera gener differentiellt uttryckt mellan dessa steg. Frierson et al. (2002) använde oligonukleotidmikroarrayanalys för att studera uttrycket av 8,920 olika mänskliga gener i 15 adenoidcystiska karcinom (ACCs), en ACC-cellinje och fem normala stora spottkörtlar., Bland gener med förändrat uttryck i ACC var de som kodade transkriptionsfaktorerna SOX4 och AP-2 gamma, kaseinkinas 1 samt epsilon och frizzled-7, vilka båda är medlemmar i Wnt/beta-catenin signaleringsvägen. I en mycket ny studie, Leethanakul et al. (2003) genererade cDNA-bibliotek med hög komplexitet från laser capture microdissected normal och cancerous squamous epitel. I denna studie undersökte författarna tillgänglig sekvensinformation med hjälp av bioinformatiska verktyg och identifierade 168 nya gener differentiellt uttryckta i normalt och malignt epitel., Dessutom, med hjälp av cDNA-arrayer, erhöll de bevis för att en delmängd av dessa nya gener kan uttryckas högt i HNSCC.
mikroarray och bröstcancer
med tanke på den kliniska heterogeniteten hos bröstcancer kan mikroarray-tekniken vara ett idealiskt instrument för att skapa en mer exakt klassificering. Inledande studier med mikroarraybaserad uttrycksprofilering visade sin förmåga att korrekt klassificera östrogenreceptornegativa och östrogenreceptorpositiva bröstcancer (Perou et al., 2000, West et al.,, 2001) och att skilja BRCA1-relaterade tumörer från BRCA2-relaterade och sporadiska tumörer (Hedenfalk et al., 2001; van ’ t Veer et al., 2002).
studien av van ’ t Veer et al. har varit en av de mest omfattande och informativa studier som hittills utförts. Författarna undersökte 117 primära bröstprover av mikroarray-baserade genuttryck profilering för att utveckla prognostiska profiler och jämföra dessa med kända prognostiska markörer i bröstcancer. Av de 5 000 generna med variabla uttrycksprofiler identifierades 70 för optimal noggrannhet vid förutsägelse av återkommande sjukdom., Med hjälp av denna klassificering förutspådde författarna korrekt det faktiska resultatet av sjukdomen för 65 av de 78 patienterna. Fem patienter med god prognos och åtta patienter med dålig prognos var felaktigt tilldelade. Standardprognostiska markörer i bröstcancer användes för att uppskatta risken för canceråterfall och hjälpa till att fatta beslut om adjuvant terapi. Tyvärr identifierar nuvarande prognostiska markörer inte adekvat den mest korrekta behandlingen för patienten., Den prediktiva kraften i microarray-tillvägagångssättet är mycket större än för närvarande använda tillvägagångssätt, men det måste valideras i mer prospektiva kliniska studier. Om det prognostiska värdet av detta tillvägagångssätt bekräftades skulle klassificeraren för uttrycksprofilering resultera i en fyrfaldig minskning hos patienter som får adjuvant behandling i onödan (Caldas och Aparicio, 2002).
Martin et al. (2001) beskrev en metod för att identifiera cirkulerande bröstcancer genom en tvåstegsprocess med differentialdisplay och högkänslig array-baserad uttrycksprofilering., Även om potentialen i denna teknik är lovande, dess känslighet och specificitet fortfarande behöver förbättras och mer arbete krävs för att bestämma den kliniska betydelsen av genuttryck profil upptäckt i perifert blod. Vissa artiklar har nu visat en koppling mellan tumöruttryck profiler med hjälp av microarray teknik och kliniskt resultat. Till exempel, Sorlie et al. (2001) visade att tumörsubklasser definierade genom uttrycksprofilering kan förutsäga sjukdomsfri och övergripande överlevnad och Sotiriou et al., (2002) visade att pre-treatment expression profiles förutspådde kliniskt svar på kemoterapi i ett litet urval av brösttumörer. Även om studien av Sorlie et al. var mycket provocerande, författarna jämförde inte det prognostiska värdet av de grupper som identifierats av hierarkisk kluster med för närvarande använda prognostiska faktorer i bröstcancer., Eftersom läkemedelsresistens i cancer är ett stort hinder för framgångsrik kemoterapi är möjligheten att erhålla en potentiell molekylär profil eller fingeravtryck av cancerläkemedel i cancerceller med mikroarray-teknik avgörande för att förutsäga kemoterapisvar. Kudoh et al. (2000) visade denna förmåga att definiera förändringar i genuttryck profiler i en bröstcancercellinje som behandlas med kemoterapi. De övervakade uttrycksprofilerna för MCF-7 bröstcancerceller som antingen behandlades transient med doxorubicin eller valdes för resistens mot doxorubicin., Denna studie visade att övergående behandling med doxorubicin förändrade uttrycket av en varierande grupp gener på ett tidsberoende sätt.
mikroarray och äggstockscancer
under de senaste åren har flera utredare publicerat intressanta studier om uttrycksprofilering av äggstockscancer. Martoglio et al. (2000) analyserade genuttrycksprofilerna för fem normala äggstockar och fyra dåligt differentierade serösa papillära adenokarcinomprover från äggstockar., Med hjälp av ett litet ”internt” nylonmembran cDNA-mikroarray fann de en total ökning av angiogenesrelaterade markörer (t.ex. angiopoietin-1, VEGF), apoptotiska och neoplastiska markörer, immunresponsmediatorer och nya potentiella markörer för äggstockscancer (t. ex. cofilin, moesin och neuron-restriktivt ljuddämparefaktor protein) i cancervävnaden. Studien var spännande eftersom de använde en billig cDNA-array skräddarsydd för studier av specifika vägar, såsom angiogenes och tumorigenes., Eftersom det är problematiskt att få tillgång till en tillräcklig mängd tidig äggstockstumörvävnad, använde forskarna olika strategier för att kringgå behovet av vävnadsmängder som vanligtvis krävs av mikroarrayanalys. Till exempel Ismail et al. (2000) rapporterade en studie av 864 DNA-element som screenas mot 10 ovariecancerceller linjer och fem normala epitelcellinjer med hjälp av kortvarig cellkultur för att expandera ovarieytan epitel före rna-extraktion., Andra undersökare renat ovariepitel genom in vitro-förfaranden, såsom vidhäftning till glas eller immunomagnetisk anrikning (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Dessa två tillvägagångssätt kan emellertid införa fördomar i observerat genuttryck. Faktum är att det första tillvägagångssättet (Ismail et al., 2000) använder odlade cancerceller, som kanske inte återspeglar cancerformer in vivo på grund av möjligheten till sekundära genuttryck förändringar som sker in vitro som ett resultat av odlingsförhållanden. Den andra strategin (Ono m. fl., 2000; Welsh et al.,, 2001b) är mycket lång och kan resultera i nedbrytning av mindre stabila RNA budbärare. För att undvika eventuella fördomar inneboende i in vitro kulturer används i vissa studier (Ismail et al., 2000; Matei m.fl., 2002), andra utredare har studerat genuttryck mönster direkt från kirurgiskt resekterade tumörer (Shridhar et al., 2001). Små, specialiserade mikroarrays har flera praktiska fördelar och kan avslöja information som kan gå förlorad i större mikroarrays. Sawiris et al., (2002) använde en högspecialiserad cDNA-mikroarray som heter ”Ovachip” och fann denna mikroarray extremt känslig vid differentiering av äggstockscancer från koloncancer baserat på genuttryck mönster. Screening biomarkörer för äggstockscancer är mycket viktiga på grund av det sena skedet vid diagnos och dålig överlevnad i samband med denna typ av cancer., Nyligen använde två studier microarray-teknik för att identifiera två överuttryckta potentiella äggstockscancer serummarkörer som kallas osteopontin och prostasin, och rapporterade preliminär validering av deras användning för tidig upptäckt av sjukdomen (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).
Microarray och andra cancerformer
tillämpningen av microarray teknik till andra mänskliga cancerformer expanderar snabbt. Den banbrytande studien av Golub et al., (1999) visade möjligheten att skilja akut myeloisk leukemi och akut lymfoblastisk leukemi (ALL) baserat på övervakning av genuttryck och hur de två klasserna i en simulerad situation ”förblindad” till den histologiska diagnosen kunde ha upptäckts av genuttrycksmönstren ensam. Alizadeh et al. (2000) identifierade de två formerna av diffust stort B-cellslymfom (DLBCL) på grundval av genuttrycksprofiler som indikerar olika stadier av B-celldifferentiering., Intressant har denna molekylära klassificering prognostiskt värde oberoende av stratifiering genom den vanliga kliniska graderingen. För att studera genuttryck i lymfoida maligniteter skapade en stor samarbetsgrupp en specialiserad mikroarray, kallad ”Lymfochip”, som är berikad i gener som selektivt uttrycks i lymfocyter och i gener som reglerar lymfocytfunktionen (Alizadeh et al., 1999). Denna grupp använde denna mikroarray för att undersöka DLBCL och hittade två molekylärt olika former av denna tumör., Vidare visade de att DLBCL-undergrupperna definierade en undergrupp av patienter med en distinkt klinisk prognos. För att testa hypotesen att B-cell kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) är mer än en sjukdom, Rosenwald et al. (2001) relaterade CLL: s genuttryck mönster till deras ig-mutationsstatus och till andra typer av normala och maligna B-celler. Intressant, de gener som identifierats som mycket uttryckt i CLL jämfört med DLBCL uttrycktes likvärdigt i alla CLL prover oavsett deras ig mutationsstatus., Denna studie föreslog att alla CLL-fall delade en gemensam mekanism för omvandling och/eller ursprungscell. En nyligen genomförd studie (Stratowa et al., 2001) har föreslagit en lista över potentiella nya prognostiska markörer som är involverade i lymfocythandel och i samband med sjukdomsstationering och/eller patientöverlevnad.
i en mycket ny studie, Gariboldi et al. (2003) analyserade genuttrycksprofilerna i den normala vävnaden hos hudtumörkänsliga och resistenta möss för att identifiera gener som spelar en funktionell roll i genetisk mottaglighet., Denna studie har föreslagit en roll av Scca2-genen, en medlem av serinproteashämmaren superfamily, i den genetiska predispositionen mot hudtumörer.
Microarray teknik har också använts för att analysera melanom (Bittner et al., 2000). Denna studie föreslog att genuttrycksprofiler inom en enskild patients vävnad kan vara anmärkningsvärt bevarade över tiden och att global transkriptanalys kan identifiera okända subtyper av kutant melanom och förutsäga experimentellt verifierbara fenotypiska egenskaper.,
studier på kolon cancerceller och vävnader visade signifikant undertryckande av kinasgenen, WEE1Hu (Backert et al., 1999).
många transkriptomer förändras efter specifik överuttryck av tumörrelaterade gener. Till exempel har vi använt ett adenovirus-medierat uttryckssystem av RB2 / P130 tumörsuppressorgenen i en icke-liten lungcancercelllinje för att identifiera specifika gener som regleras av pRb2 / p130 (Russo et al., 2003)., Våra microarray resultat har identifierat en mängd olika gener som är involverade i många cellulära processer, inklusive celldelning, cellsignalering/cellkommunikation, cellstruktur/motilitet och genuttryck och metabolism. Dessa resultat tyder på nya potentiella terapeutiska biomarkörer i lungkarcinom. Dessutom visar resultaten från en annan cDNA microarray-studie att överuttryckningen av tumör-suppressorgenen PTEN kan hämma lungcancerinvasionen genom att nedregulera en panel av gener (Hong et al., 2000)., Mot bakgrund av ovanstående data är det uppenbart att mikroarraymetoden är mycket viktig vid analysen av olika tumörtyper.