Telomere struktur — funktion relation
som tidigare nämnts, i avsaknad av telomeras, telomerer blir icke-funktionella, förkorta med successiva celldelningar, och kromosom termini kan säkras som en följd av de-skydd. Telomere fusioner är resultatet av icke-homolog-end-joining (NHEJ) som är en av de rådande mekanismerna för en dubbelsträngsbrytning (DSB) läkning., Resultatet av sådana händelser kan vara skapandet av kromosomer som bär mer än en centromeres, som sannolikt kommer att slås samman till motsatta poler under mitos, vilket resulterar i kromosombrott och ytterligare genomisk instabilitet genom upprepade fusionsbrott händelser. I ryggradsdjur tillskrivs rollen som kromosomslutskydd för att särskiljas från kromosombrott ett specifikt komplex av proteiner som kollektivt kallas shelterin. Shelterin-komplexet består i grunden av sex proteiner., Två medlemmar av shelterin komplexa, TRF1 och TRF2 (från Telomer-Upprepa-bindande Faktor 1 och 2) binder direkt till dubbla strandsatta telomeric sekvens, medan POT1 binder ssDNA. TRF2 interagerar med och rekryterar RAP1, medan TIN2 förmedlar TPP1 – POT1 bindning till TIRF1 / TIRF2 kärnan komplex. POT1 binder till och skyddar de 3 enkelsträngade DNA-överhänget av telomerer (g-svans), medan TIN2 sannolikt länkar de enkla och dubbelsträngade DNA-bindande komplexen, särskilt inom området för telomerisk d-slingbildning (figur 3)., Det verkar som om denna kärna shelterin komplex är huvudsakligen belägen vid telomere änden (även kallad telosom) och tjänar både i stabiliserande t-loop struktur, skydda den samtidigt från att erkännas som DNA-skada och repareras av NHEJ. Dessutom reglerar shelterin tillgång till restaureringsprocesser av telomeriskt DNA efter varje genomreplikation., I allmänhet verkar shelterin complex fungera som en plattform som reglerar rekrytering av en växande lista över faktorer som är involverade i kromatin ombyggnad, DNA-replikering, DNA-skada reparation, rekombination och telomeras funktion, vilket reglerar telomere tillgång / modifiering av olika cellulära processer (figur 4), som nyligen granskades i .
Figur 3.
schematisk modell av potentiella telomere tak arrangemang av shelterin komplexet., Proteiner av shelterinkomplexet deltar i telomere-skydd, replikation och längdreglering. TRF1 och TRF2 proteiner som binder specifikt till telomeric ds-DNA, medan POT1 (TPP1) erkänner ssDNA (stabiliserande D-loop). TIN2 kopplar ssDNA till dsDNA-bindande komplex, stabiliserande telosomstruktur. Telomeriskt DNA består av repetitiv DNA-sekvens, en duplexregion och en ssDNA g-strand overhang (g-strand, orange; C-strand, blå). Shelterinkomplexet binder till både duplex-och ssDNA-regionerna genom specifika protein–DNA-interaktioner., Bildandet av T-slingan innebär stränginvasion av G-överhäng för att skapa en förskjutningsslinga (d-loop). T-slingan föreslås för att maskera kromosomänden från DNA-skador sensorer. Av enkelhetsskäl avbildas shelterinkomplexet som ett sexproteinkomplex homogent dispergerat på telomere. Se text för ytterligare detaljer.
intressant verkar det som om mer än en typ av kärnskylterinkomplex existerar och inte alla är nödvändigtvis en del av telosomen. Komplexen innehåller endast TRF1-TIN2-TPP1-POT1 eller TRF2-RAP1 har upptäckts., De senaste uppgifter som mäter den absoluta och relativa mängder av TRF1 och TRF2 i cellen visade att TRF2 är ungefär dubbelt så riklig som TRF1 och detta är förenligt med TRF2 upptäcks i rumsligt riktad DNA-skador inducerad foci i icke-telomeric kromosom regioner. TRF2 rekrytering till platser av DNA-skada överensstämmer med det spelar en viktig roll i DNA-skada svar . Komplexiteten hos det telosomskapade nätverket är praktiskt taget baserat på shelterins unika strukturella egenskaper., TRF1 och 2 bär en SAB / MYB-domän genom vilken de båda känner igen ett ttagggtta-motiv på telomere DS DNA, ett surt rikt (D/E) terminalområde och ett specifikt dockningsmotiv som kallas TRF homologi (TRFH) motiv . Den TRFH domän förmedlar homo-dimerization av TRF1 eller TRF2 men förbjuder heterodimerization på grund av strukturella hinder . En FxLxP motiv och en Y/FxLxP motiv som krävs för TRF1 och TRF2 bindande, respektive. Dessa domäner kallas TRFH bindande motiv (TBM). Den Phe 142 aminosyra rester i TRF1-TRFH motiv är ansvarig för TIN2 bindande genom sin TBM regionen., TIN2-TBM har betydligt lägre affinitet för motsvarande regionen TRF2 (Phe 120) till följd av strukturella skillnader i närheten av Phe 120 och slutligen är ansluten till TRF2 via en unik TRF2 regionen nära N-terminalen av protein. Dock Phe 120 rester är avgörande för specifik interaktion med andra telomer associerade faktorer som Apollo nuclease, en TRF2 bindande partner. Komplex bildning mellan shelterin-kärnmedlemmar och associerade faktorer med TBM-liknande motiv kommer sannolikt också att styras av förändringar i bindande affiniteter på grund av post-translationella modifieringar., Ett fint exempel är TRF1 parsylation av tankyrase, vilket resulterar i betydande minskning av DNA-TRF1 affinitet, så förlänger telomeren och syster telomerer separation genom att särskilt lindra sammanhållning komplex från TRF1 och TIN2 . Obalans av sådana interaktioner kan vara skadligt för genomintegritet som visas av förhöjda nivåer av TIFS bildade i celler överexpressing en isolerad TBM som en tandem YRL upprepning. Analoga skadliga resultat erhölls när man uttryckte en TRF2-F120 substitution allel .,
nyligen genomförda strukturella studier av en av de två ob-(oligonukleotid/oligosackaridbindande) vecken av S. pombe Pot1, som utgör bindningsstället för ssDNA, visade att icke-specifik nukleotid erkännande av ssDNA uppnås genom hittills oidentifierade bindningslägen som termodynamiskt kompenserar för bassubstitutioner genom alternativa staplingsinteraktioner och nya h-bindningsnät . Således, avgränsa i detalj strukturen av shelterin medlemmar och tillhörande faktorer förväntas geometriskt förbättra vår förståelse av nätverken bestod och hur kvantitet vs, kvalitetsförändringar stör strukturella modifieringar som leder till funktionella förändringar, finjustering genomstabilitet. Utan tvekan har den mängd information som samlats in redan banat vägen för att använda anti-telomerasmedel i kliniska prövningar, med robust förväntat resultat.
förutom shelterin och interagerande partner har ett annat viktigt komplex nyligen visat sig vara involverat i telomerebiologi, CST-komplexet. CST-komplexet består av CTC1, STN1 (OBFC1) och TEN1, och har tillskrivits räddning av stallade replikationsgafflar under replikationsspänning., CST-komplexet kopplar samman telomerer med genomreplikering och skydd oberoende av Pot1-vägen .
samla bevis från många publikationer ganska oväntat visat att DNA skada svar (DDR) och reparationsvägar, trots verkar en paradox, dela gemensamma funktioner med telomere underhållsstrategier. DDR tidiga responsproteiner rekryteras till telomerer och proteiner som tros fungera i telomere underhåll har också bevisats vara involverade i DDR., Paradoxalt nog verkar DDR-faktorer i telomerer, under normala förhållanden, störa telomere restaurering och längdbevarande. Detta distinkta fenomen tillskrivs shelterin samordning av DDR faktorer tillgång och funktion på telomerer. TRF2 kan binda till och hämma ATM, medan POT1 när bundna till G-tail genom TPP1, hämmar ATR. Undertryckande av TRF2 aktivitet framkallar p53 och ATM aktivering, vilket leder till telomere dysfunktion inducerad foci (TIFs). TIFs resulterar i end-to-end telomere fusioner via nhej vägen och deras utseende är korrelerad med induktion av senescence ., Samspelet verkar vara baserat på shelterin kvantitet och telomere längd, två parametrar direkt relaterade till varandra, som när telomerer är kritiskt korta är de mindre benägna att bilda en T-loop, en reaktion katalyserad av TRF2 in vitro, och i sin tur är mindre shelterin bunden till . Följaktligen reduceras två stora telomere-underhållsstrukturer signifikant (t-loop och shelterinbeläggning), vilket möjliggör DDR-aktivering., Men ändå, ganska spännande, NHEJ maskinen kan också ha en skyddande roll vid telomerer genom enzymatisk aktivitet av Tankyrase relaterade till främjande av DNA-PKcs stabilitet och åtgärder för att förhindra bildandet av dna-sister chromatid utbyte (T-Sce-föreningar) som en produkt av inter-telomer rekombination
en Annan spännande paradigm är det MRN komplex (ett protein komplex av meiotic rekombination 11 (MRE11) – RAD50 och NBS1 proteiner), där en enda NBS1 molekyl som är associerad med två dimerer av MRE11 och RAD50 ., Den MRE11 och RAD50 proteiner som bildar en heterotetramer som innehåller två DNA-bindande och bearbetning domäner som kan överbrygga gratis DNA slutar . Den MRN komplexa lokaliserar att telomererna under S och G2 faser av cellcykeln genom direkt interaktion av NBS1 med TRF2, förmodligen bidrar till G-tail-formation om de ledande telomeric strand och därmed telomer stabilitet ., Hos människor leder mutation i NBS1-genen till kromosomal instabilitetsstörning, Nijmegen-brottssyndrom 1, associerad med ökad känslighet för joniserande strålning och kromosomal instabilitet och tidig utveckling av cancer även i NBS1+/- heterozygoter. NBS1 innehåller en forkhead-associerad (FHA), en BRCT (BRCA1 C Terminus) domän, en MRE11-bindande domän, och en ATM-interagera domän. Ackumulerande bevis visar att NBS1 interagerar med telomerer och bidrar till deras stabilitet, åtminstone i human-och musceller., Indirekta immunofluorescensexperiment visade att NBS1 samlokaliserar med TRF2 under S-fasen i odlade Helceller, eventuellt genom att modulera t-slingbildning. Eftersom TRF2 också har hittats på icke-telomera sekvenser kräver effekterna av NBS1 samlokalisering med TRF2 ytterligare förtydliganden. På samma sätt har aktiv rekrytering av NBS1 till dysfunktionella telomerer observerats hos embryonala fibroblaster från mus . MRN-komplexet verkar spela en dubbel roll i telomerebiologi. En är att medla, åtminstone delvis, ATM svar som leder till TIF formation efter TRF2 radering ., För det andra krävs det genom sin nukleasaktivitet för normal telomerebildning, eftersom MRN är inblandad i behandlingen av skadade telomerer genom att påverka produktionen av överhäng från en trubbig ände telomere skapad efter telomere-replikering . Sådan acceleration av G-svans bildning, efter telomere dysfunktion / de-skydd förhindrar fusion av ledande trubbiga ändar strängar av de-skyddade telomerer under S-fasen. Apollo-nukleas kan också rekryteras och vara involverad i denna process., Direkt interaktion av NBS1 med telomere repeatbindande faktor 1 (TRF1) har visats för odödliga telomeras negativa celler vilket innebär att denna interaktion kan vara involverad i den alternativa förlängningen av telomerer. Vidare kan MRN-komplexet i telomeras-Uttryckande celler genom nedreglering och avlägsnande av TRF1 (NBS1-beroende fosforylering av TRF1 av ATM) också främja tillgängligheten av telomeras till 3-änden av telomerer ., DNA-reparation interkommunikation med telomere stabilitet är ett förhållande som etablerats ganska tidigt i utvecklingen, vilket indikeras av det faktum att MRE11 och RAD50 tillsammans med proteinkinaser ATM och ATR, är också nödvändiga för korrekt telomere underhåll i växter .
Figur 4.
Shelterin associerade faktorer också involverade i DNA skada svar., Detaljer i texten
nyligen, ett annat proteinfosfatas, munkar (fosfatas 1 nukleär inriktning subenhet), som interagerar med TRF2, infogar en annan bit i pussel av DDR och telomere relation . Dessutom detekteras genom att söka efter TBM-innehållande proteiner, samverkar den tre BRCT-domänen med MCPH1 proximal DDR-faktorn också med TRF2. MCPH1 mutationer är associerade med utvecklingsfel och ökad tumörincidens ., MCPH1 utarmat cellerna som finns minskade nivåer av BRCA1 och Chk1 och är defekta i den G2/M kontrollpunkten .
en viktig roll i telomeres integritet tillskrivs också BRCA2, en nyckelkomponent i HR DNA-reparationsvägen. BRCA2 associerar med telomerer under S / G2-cellcykelfaserna och verkar underlätta RAD51 – rekombinasbelastning . Därför är BRCA2-medierad HR-aktivitet krävs för telomere längd underhåll. Dessa fynd kan förklara, åtminstone delvis, de kortare telomererna som finns i BRCA2 muterade humana brösttumörer., Därför kan telomere-dysfunktion också vara inblandad i den genomiska instabiliteten som observerats vid BRCA2-bristfälliga bröst-och äggstockscancer .
totalt har ett antal DNA-reparationsmolekyler, som kollektivt ingår i HR, Nhej, NER och Fanconis Anemivägar, visat sig rekryteras på telomerer, med TRF2 som huvudsakligen fungerar som ett proteinnav., Under normala förhållanden är ATM / ATR-signalering, vid avskydd på grund av kort telomerelängd och efterföljande ”pensionering” av cellen (senescence / apoptos) en del av den normala, tumörinitieringsskyddsmekanismen mot genomdestabiliserade celler. I celler som bär normal telomere längd finns det hämmande relationer mellan dessa olika DNA-reparationssystem, vilket förhindrar varandras aktivering.
telomerer är en del av heterochromatin struktur vilket innebär att specifika signaler definierar deras placering i kärnan., Även om det faktum att telomerer förväntas vara per definition stabila och inerta kromosomändar, verkar det ändå vara dynamiska nukleoproteinkomplex som också är involverade i ombyggnad av kromatin. Rekrytering av heterochromatin bindande protein HP1 , berikad tri-metylering av histon H3 lysin 9 (H3K9) och H4K20 , liksom metylering av CpG dinucleotides i subtelomeric DNA upprepar stöd för denna uppfattning. Dessa heterokromatiska märken ersätts av egenskaper hos öppna kromatin (ökad acetylering på histonstjärtar etc.) när telomerer blir kortare., Sådana förändringar innebär att en minsta telomere längd krävs för att upprätthålla heterokromatinliknande konformation vid kromosomändningar, en struktur som kan förändras efter telomere avgång. Dessutom bör telomerer och shelterinkomplexet lossa sin snäva struktur under kromosomreplikation och återupprätta sin kompakta form efter avslutad DNA-duplicering. En analog lossning av telomeres struktur bör krävas vid telomereåterställning genom antingen telomeras-eller DNA-reparationsmekanismer, även om det eventuellt kan ske genom olika förfaranden., För att uppnå denna plasticitet bör kromatin omformas genom ett antal enzymer, enligt en lokal histonkod . Ett antal Histon modifieringar är inblandade där distinkta Histon svans-protein interaktioner främja telomere komplex struktur avkoppling eller kompression . Som ett exempel, SIRT6 (en Histon h3k9 deacetylas som modulerar telomerisk kromatin) utarmning experiment genom RNA-interferens gav bevis på ökad nukleär DNA-skada och bildandet av telomere dysfunktion-inducerade foci., Dessa experiment föreslog att SIRT6 skyddar endotelceller från telomere och genomisk DNA-skada, vilket förhindrar en minskning av replikativ kapacitet och början av för tidig senescens, i detta speciella fall inblandad i att upprätthålla endoteliala homeostatiska funktioner och fördröja vaskulär åldrande.
en annan viktig uppsättning faktorer som är involverade i telomerebiologi är produkterna av ATRX-och DAXX-gener, vilka är inblandade i kromatin-ombyggnad tillsammans med histone h3.3 ., Mutationer eller deletioner i dessa genetiska loci har direkt korrelerat med ALT+ – status på cellinjer eller tumörer i sig . Enligt dessa fynd kan screening för ATRX / DAXX-mutationer / uttryck representera den mest aktuella tillförlitliga markören för tumörer som har valt ALT TMM-vägen.,
kollektivt är det den korrekta sammansättningen av skyddsrum i telomerer som är avgörande för kromosomstabilitet (differentierar kromosomändarna från DNA ds-raster och förhindrar förlust av genetisk information genom antingen nukleolytisk attack (exonukleasmedierad nedbrytning) eller avvikande kromosomfusioner och oönskad rekombination, under en Cells livslängd., Tillsammans med rätt struktur regleras funktionell koordinering som styr TMM och telomerasaktivitet strikt under hela cellcykeln av ett antal implicerade tillbehörsfaktorer, som transient rekryteras av shelterinkomplexen / subkomplexen .
bortsett från deras skyddande roll, korrekt interaktion av skyddsrum med komponenter i DNA reparation maskiner samt telomeras komponenter och telomeras rekrytering, möjliggör telomere restaurering när så är lämpligt., Betydelsen av den korrekta strukturen – funktionen hos shelterin-komponenter i telomerebiologi och cancerbildning, tillsammans med telomererelaterade sjukdomar, avbildas av association of mutation detection i dvs TIN2 i många av dessa fall .