introduktion
Ambergris, en känd naturprodukt av valen , finns också som jetsam på stränder över hela världen , och har varit mycket uppskattad för sin nytta i parfymindustrin . Även om det länge har hållits att jetsam ambergris som samlats in på stränder härstammar från spermhvalar, har små eller inga bevis för detta någonsin publicerats, och skillnader finns mellan sådana prover och prover av ambergris direkt från spermhvalar., Till exempel innehåller jetsam ambergris-prover i allmänhet mycket högre proportioner av triterpenoida alkoholambrein och mycket lägre proportioner av steroler än gör prover av ambergris från spermhvalar . Omvänt men jetsam ambergris innehåller ibland fragment av bläckfisk näbbar, och eftersom bläckfisk, såsom bläckfisk, utgör den viktigaste kostkomponenten i spermhvalar, detta har nämnts som bevis på ett ursprung av jetsam coproliter från spermhvalar. Det är även teoretiserade ambergris kan härröra som en patologisk utsöndring från irriterande av hård bläckfisk näbb kitin ., Andra marina däggdjursarter (t .ex. medlemmar av Globicephala och Ziphiidae) förekommer också på bläckfisk , och vissa (inklusive dvärg-och pygmévalar) nämns också som potentiella källor till ambergris. För att ytterligare belysa ursprunget till jetsam ambergris analyserade vi därför DNA från ett ambergrisprov som samlats in från en spermhval som strandade i Nederländerna och jämförde det med DNA-sekvenser isolerade från jetsam ambergris som samlats in från stränder i Nya Zeeland och Sri Lanka.,
Ambergris anses huvudsakligen bestå av ambrein på grund av dess produktion från skvalen, en vanlig metabolisk produkt i många organismer . Denna process kan induceras av tarmens mikrobiella inflytande och fälls ut i täta, fasta massor inom valkolon. De coprolitiska accretionerna som resulterar är kompositionellt väl lämpade för att bevara DNA från tjocktarmen eftersom ambrein är hydrofob och uppenbarligen resistent mot nedbrytning i den sura enteriska miljön., Bevis från radiokarbon dejting indikerar säkert motstånd mot mikrobiell och foto-nedbrytning i den marina miljön i upp till ett årtusende i vissa jetsam ambergris prover . Vi hypoteser att sådant material kan ge en lämplig cache för att bevara DNA, även efter långvarig exponering för skadliga förhållanden till sjöss.
Material och metoder
Jetsam ambergris prover från Nordsjön, Indiska oceanen och Stilla havet analyserades, representerar materialets globala distribution ., Tre skärvor ambra exemplar (en från Sri Lanka, två från Pitt Island, Nya Zeeland) var subsampled för DNA-extraktion. Ett fjärde prov härstammar från dissektion av en manlig spermhval strandad i December 2012, vid Razende Bol nära Texel, Nederländerna. Den senare ”färska” ambergris, från en bekräftad spermvalkropp, gav en känd jämförelse med jetsamproverna med obekräftad biologisk historia. Prover av ambergris erhölls och analyserades för ambrein-och fekal sterolhalt i tidigare studier .,
DNA-extraktion och sekvensering genomfördes vid GLOBE Institute, Köpenhamns universitet, i ett dedikerat gammalt DNA-laboratorium efter strikta förfaranden för minimering av förorening. Cirka 120 mg subsampleddes (figur 1 och Tabell 1) för DNA-extraktion. Prover inkuberades i 400 µl proteinas k-innehållande buffert efter Gilbert et al. vid 56 ° C för 10 h; supernatanter behandlades sedan med ett fenolkloroformsteg efter Carøe et al., och renas med monark DNA Cleanup Columns (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) enligt tillverkarens riktlinjer. Dubbelsträngade bibliotek byggdes från DNA-extrakt efter det bästa protokollet, utformat och bevisat speciellt för sekvensering av gammalt och försämrat DNA. Biblioteken förstärktes och indexerades genom PCR med PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) enligt tillverkarens riktlinjer., Produkterna samlades vid ekvimolär koncentration innan sekvensering på en Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) plattform, med hjälp av 80 bp enda ände läs kemi vid den danska nationella hög genomströmning DNA sekvensering centrum, Köpenhamn, Danmark.
Figur 1. Närmare uppgifter om analyserade ambergrisprover. (a) karta som visar orter där ambergris prover ursprungligen hittades., (B) fotografier som visar stor mångfald i fysiska egenskaper hos ambergrisfragment: TEXEL151212 (från dissekerat valprov) var kornig i konsistens, medan jetsamprover ytligt verkade tätare och heterogena, och var internt equigranulära och signifikant blekare i färg.
| prov | plats | Total massa (g) | analyserad th> | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Island, Nya Zeeland | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | west Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Nederländerna | 83000 | 92 | 93 |
| prov | Total bibehållen läser | Genomsnittlig bibehållen läslängd (bp) | Total aligned reads (mtDNA) | tider för täckning (mtDNA) | Total aligned reads (whole genome) | tider för täckning (hela genomet) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0,175 | 12 782 | 0,0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71,7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0,00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
sekvensanalys gjordes på högpresterande datoranläggning vid Köpenhamns universitet, med FASTQ-filer som behandlades med PALEOMIX-rörledningen (v .1.2.13). FastQC v. 0.11.8 användes ursprungligen för kvalitetskontroll av råsekvensdata. Adaptrar trimmades med AdapterRemoval v. 2.3.1, med läser mindre än 25 bp också bort. Läsningar mappades sedan till referenssekvenser med BWA och tillämpade även mapDamage2.,0 för grundläggande nedbrytning kvantifiering, producerar anpassningar med referenssekvenser. ANGSD användes sedan för att producera sekvenser i FASTA-format.
osäkerhet kring ursprunget och de biologiska mekanismerna för produktion av ambergris fick oss att överväga flera möjliga kandidatvalar och pinniped arter i sekvensanalys. Artidentitet utlästes genom att kartlägga framgång och fylogenetiskt förhållande till 19 valar och pinniped kandidatarter i NCBI RefSeq (se det elektroniska kompletterande materialet)., Dessa arter valdes ut baserat på potentiell lämplighet som djupdykande marina däggdjur som fyller en liknande ekologisk nisch till spermhvalar, för att utesluta att sådana arter är samanpassade för att producera ambergris. Provsekvenser sammanfogades och justerades med MAFFT v. 7.392 . Fylogenetiska trädmodeller producerades sedan i MEGA X med hjälp av Maximum-likelihood-metoden med Hasegawa-Kishino-Yano-modellen, med avstånd beräknade med den maximala sammansatta sannolikhetsmetoden (detaljer om alla referenssekvenser som används ingår i det elektroniska kompletterande materialet).,
resultat
de fylogenetiska analyserna stödde otvetydigt spermhvalens ursprung för de fyra ambergrisproverna (figur 2; elektroniskt kompletterande material, figur S1). Likaledes, anpassning till Physeter macrocephalus mitokondriell referens genom från NCBI (NC_002503.2) producerade den högsta täckning resultat för alla prover av alla anpassningar gjorda och ger en säker tilldelning, men med betydande variationer i framgång mellan prover. Sekvensering av provet från en strandad spermhval (TEXEL151212) producerad överlägset högsta täckning (ca., 20×) för spermhval mitokondrion, medan ett av jetsamproverna från Pitt Island (S. 01) endast gav ungefär 0.2× täckning (se Tabell 2). Anpassningar med Kogia sima (dvärg sperm whale) och Kogia breviceps (pygmé sperm whale) referens mitokondriella genomet (NC_041303.1, NC_005272.1) har också gett täckning (uppgifter i elektronisk kompletterande material), men många mycket bevarad funktionella regioner delas mellan analyserade arter, vilket resulterar i hög likhet i sekvens . Täckningen för kogiid-arter var emellertid vanligtvis runt en faktor på 10 mindre än för fysiker., Anpassningen till P. macrocephalus hela nukleära referens genomet (ASM283717v2) var också framgångsrik, även om detta är mer uppenbart i jämförelser av det totala antalet läsningar mappas till genomet. Anpassning för Architeuthis Dux (jätte bläckfisk), ett välrenommerat vanligt byte av spermhvalar (t .ex.), misslyckades, men detta är inte deras dominerande byte.
Figur 2. Maximal sannolikhet fylogenetisk trädmodell som genereras från referenssekvenser och inriktade prov mitokondriella genom., Proverna är tydligt placerade som gruppering med spermhval (P. macrocephalus) snarare än dvärg-och pygmy spermhvalar (Kogia spp.). Detta träd återspeglar den högsta log-sannolikhetsmodellen, värdena återspeglar andelen träd som beräknats där den tillhörande taxa var grupperade, vilket indikerar förtroende för positionering och grenlängder mäter antalet substitutioner på varje plats (se skala). Figur producerad i MEGA X . Whale skildringar från: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Ett fylogenetiskt träd inklusive alla 19 kandidatarter presenteras i elektroniskt kompletterande material, figur S1.
resultat från MapDamage visar anmärkningsvärt liten variation mellan prov som påverkar C till T övergångar vid 5′ strängändarna, men en högre procentandel av G till en övergång vid 3′ änden finns för S. 01 (detaljer i elektroniskt kompletterande material, figur S2), vilket indikerar möjlig högre biomolekylär nedbrytning., I allmänhet har dock mycket liten kemisk modifiering inträffat, och fördelningen av förändringar över strängar förblir enhetlig och platt.
diskussion
denna studie har visat att tre jetsam ambergris-prover med säkerhet kan hänföras till spermhval genom DNA-extraktion. Medan bekräftelse av ett spermhvalens ursprung för jetsam ambergris inte är ett överraskande resultat, är den nuvarande studien den första i att tillhandahålla ett betydande bevis på konceptet för att hämta endogent DNA från ambergris och framgångsrikt använda det för organismidentifiering., Viktigt är att ursprunget till alla tre jetsam ambergris-prover som studerats här kan säkert identifieras som spermhval på grundval av inte bara genetisk anpassning framgång, men också modellering av mitokondriella genom i fylogenetiska relatedness träd, inklusive för ett stort urval av outgroup marine mammal taxa., Även om alla prover som analyserats här identifierades som ursprung från val av sperma, är det fortfarande fullt möjligt att andra närbesläktade djupdykande marina däggdjur (t.ex. dvärg-och pygmévalar) kan producera ambergris och helt enkelt ännu inte har registrerats som hittills.
den främsta orsaken till den dramatiska variationen i den genetiska täckningen mellan prover är oklar. Analys av DNA-nedbrytning i mapDamage2.,0 visar liten korrelation med inriktningsskydd, vilket kan förväntas, och det finns också liten variation mellan ambreinhalten i prover som kan förväntas bidra till differentiell DNA-bevarande. Den exakta åldern för de nuvarande jetsam-proverna är okänd, även om tidigare studier har framgångsrikt radiokarbon daterat andra ambergrisprover . Radiokarbondating av relativt nya prover är dock problematisk på grund av effekterna av utsläpp av fossila bränslen , och radiokarbondatum eftersom ökningen av antropisk kolutsläpp är opålitliga., Att producera en konsekvent nedbrytningshastighet för G till en övergång i tillförlitligt daterade äldre prover kan i framtiden bidra till en bättre förståelse för differentiell DNA-skada. Ett annat alternativ för framtida forskning kan vara studier av glutamindeamidering och asparaginsyraracemisering från analys av organiska peptider, eventuellt också närvarande i ambergris . Alternativt kan dock intra-provvariation i DNA-och ambreinkoncentrationen lika sannolikt utgöra låg täckning i prov S.,01, medan nyare exponering för spermhvalvävnad otvivelaktigt står för den höga täckningen i beached whale prov TEXEL151212.
bevarandepotentialen hos ambrein fälls ut för DNA sträcker sig inte bara till endogen valgenetik utan också till metagenomisk täckning av whale gut microbiomen, och potentiellt även DNA från deras byte. Till exempel kan DNA också förbli inom delvis eller osmält bläckfiskben som finns i spermhvalens avföring och i ambergris , som till och med teoretiseras för att vara en patologisk orsak till ambergrissekretion ., Förståelsen av den prokaryota sammansättningen av microbiome miljön i ambergris kan också ytterligare belysa ursprunget till ambergris, särskilt i omvandlingen av skvalen till ambrein och den process genom vilken ambergris verkar bildas i lager av anhopning. Ytterligare analyser av endogen DNA-hämtning från jetsam ambergris, inklusive även DNA från whale gut microbiota och prey, skulle ge betydligt större insikter i sperm whale ekologi, evolution och metabolism.,
slutsats
Jetsam ambergris har länge varit ett gåtfullt material, föremål för diskussion och analyser i vetenskapliga publikationer sedan artonhundratalet . Denna studie är den första som vi vet att presentera slutlig bekräftelse av det biologiska ursprunget för jetsam ambergris-prover som spermhvalar, genom DNA-analys. Utöver detta lägger emellertid den nuvarande studien ut ambergris potential som en ny källa till genetiska data relaterade till spermhvalar med en betydande livslängd över tiden., Större klarläggande återstår att uppnå genom studier av bevarandebetingelserna för DNA i ambrein och av differentialeffekterna från flera faktorer. De potentiella konsekvenserna för att hjälpa vår förståelse av tidigare befolkningsdynamik i valar och deras ekologiskt associerade taxa kan dock vara djupgående. Den äldsta kända ambergris som finns inom Pleistocenavlagringar har permineraliserade bläckfiskbakar som innehåller aminosyror som är endogena för bläckfisk, vilket författarna tillskriver bevarandekapaciteten hos det lokala sedimentet ., Även om det är osannolikt att DNA kommer att bevaras för en sådan ålder (1, 75 Ma), kan detta fynd också bero på effektiviteten av ambergris och ambrein som konserveringsmedel substrat. Mycket är fortfarande okänt om ekologin och anpassningen av de marina jättarna som tidigare kännetecknades som halvmytiska djur, och ambergris kan nu visa sig vara en liten men viktig nyckel för att förstå några ytterligare aspekter av dem.
etik
alla prover erhölls och analyserades etiskt i denna studie, en del av dnrf-128 PROTEIOS-projektet., Av de fyra ambra prover som analyserats i denna studie, tre (01 S.–S. 03) var subsampled från material som studerats av S. J. R. i tidigare publikationer (se ovan), erhållen som olycksbarn ambra hittas på stränder (prov nr ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 och ACL237-S. 03). Det fjärde provet (TEXEL151212) var vänligt som ett delprov av ambra preparatet TEXEL151212 av Dr A. Oosterbaan på uppdrag av EcoMare Museum, Amsterdam, Nederländerna, där resten av detta prov är fortfarande hålls. Vi är tacksamma för museets tillåtelse att använda detta prov.,
datatillgänglighet
författarnas bidrag
konkurrerande intressen
vi förklarar att vi inte har några konkurrerande intressen.
finansiering
finansiering tillhandahölls av den danska National Research Foundation grant PROTEIOS (DNRF128).
bekräftelser
R. M. är tacksam mot Dr J. A. Samaniego för råd om genomiska analyser, och även till M. McCarthy för råd och diskussioner. Vi är tacksamma för att Dr A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) för prov S. 04 och till anonym samlare för prover 01 S.–S. 03., Författarna skulle vilja erkänna stödet från det danska nationella Höggenomströmningscentrumet i Illumina-datagenerering.
fotnoter
elektroniskt kompletterande material finns tillgängligt online påhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
publicerad av Royal Society enligt villkoren i Creative Commons Attribution Licensehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, som tillåter obegränsad användning, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.