jorden är hem för miljontals bakteriearter, var och en med unika egenskaper. Att identifiera dessa arter är avgörande för att utvärdera miljöprover. Läkare måste också skilja olika bakteriearter för att diagnostisera infekterade patienter.
för att identifiera bakterier kan en mängd olika tekniker användas, inklusive mikroskopisk observation av morfologi eller tillväxt på ett visst media för att observera kolonimorfologi., Genetisk analys, en annan teknik för att identifiera bakterier har ökat i popularitet under de senaste åren, delvis på grund av 16S ribosomal RNA gensekvensering.
den bakteriella ribosomen är ett protein rna-komplex som består av två subenheter. 30S-subenheten, den mindre av dessa två subenheter, innehåller 16S rRNA, som kodas av 16S rRNA-genen som finns i genomiskt DNA. Specifika regioner av 16S rRNA är mycket bevarade, på grund av deras väsentliga funktion i ribosomaggregatet. Medan andra regioner, mindre kritiska för att fungera, kan variera mellan bakteriearter., De variabla regionerna i 16S rRNA, kan fungera som unika molekylära fingeravtryck för bakteriearter, så att vi kan skilja fenotypiskt identiska stammar.
Efter att ha fått ett kvalitetsprov av gDNA kan PCR av 16S rRNA-kodningsgenen börja. PCR är en vanlig molekylärbiologisk metod, bestående av cykler av denaturering av den dubbelsträngade DNA-mallen, glödgning av universella primerpar, som förstärker mycket konserverade regioner av genen och förlängningen av primers med DNA-polymeras., Medan vissa primers förstärker de flesta av 16S rRNA-kodningsgenen, förstärker andra bara fragment av den. Efter PCR kan produkterna analyseras via agarosegelelektrofores. Om förstärkningen lyckades, bör gelén innehålla ett enda band av förväntad storlek, beroende på primerparet som används, upp till 1500bp, den ungefärliga längden av 16S rRNA-genen.
efter rening och sekvensering kan de erhållna sekvenserna sedan föras in i BLASTDATABASEN, där de kan jämföras med referens 16S rRNA-sekvenser., Eftersom denna databas returnerar matchningar baserat på den högsta likheten tillåter detta bekräftelse av identiteten hos de bakterier av intresse. I den här videon, du kommer att observera 16S rRNA gensekvensering, inklusive PCR, DNA-sekvensanalys och redigering, sekvens montering och databassökning.
vid hantering av mikroorganismer är det viktigt att följa god mikrobiologisk praxis, inklusive användning av aseptisk teknik och användning av lämplig personlig skyddsutrustning. Efter att ha utfört en lämplig riskbedömning för mikroorganismen eller miljöprovet av intresse, erhålla en testkultur., I detta exempel används en ren kultur av Bacillus subtilis.
för att börja, odla din mikroorganism på ett lämpligt medium under lämpliga förhållanden. I detta exempel odlas Bacillus subtilis 168 i lb-buljong över natten i en skakinkubator inställd på 200 rpm vid 37 grader Celsius. Använd sedan ett kommersiellt tillgängligt kit för att isolera genomiskt DNA eller gDNA från 1,5 ml av B. subtilis övernattningskultur.
för att kontrollera kvaliteten på det isolerade DNA: t, blanda först fem mikroliter av den isolerade gDNA med en mikroliter av DNA-gelfärgämne. Ladda sedan provet på en 0.,8% agarosgel, innehållande DNA-färgningsreagens, såsom SYBR safe eller EtBr. Därefter laddar du en en kilobasmolekylstandard på gelén och kör elektrofores tills det främre färgämnet är ungefär 0,5 centimeter från botten av gelén. När gelelektrofores är klar visualiserar du gelén på en blå ljustransilluminator. GDNA ska visas som ett tjockt band, över 10 kilobas i storlek och har minimal smörjning.
för att skapa seriella utspädningar av gDNA, märka tre mikrocentrifugrör som 10X, 100X och 1000X., Använd sedan en pipett för att dispensera 90 mikroliter sterilt destillerat vatten i var och en av rören. Tillsätt sedan 10 mikroliter av gdna-lösningen till 10x-röret. Pipett hela volymen upp och ner för att säkerställa att lösningen blandas noggrant. Ta sedan bort 10 mikroliter av lösningen från 10x-röret och överför det till 100X-röret. Blanda lösningen som tidigare beskrivits. Slutligen överför 10 mikroliter av lösningen i 100X-röret till 1000X-röret.
för att starta PCR-protokollet, Tina de nödvändiga reagenserna på is. Förbered sedan PCR master mix., Eftersom DNA-polymerasen är aktiv vid rumstemperatur, måste reaktionen ställas in på is. Aliquot 49 mikroliter av masterblandningen i var och en av PCR-rören. Lägg sedan till en mikroliter av Mall till var och en av försöksrören och en mikroliter sterilt vatten till det negativa kontrollröret, pipetting upp och ner för att blanda. Därefter ställer du in PCR-maskinen enligt det program som beskrivs i tabellen. Placera rören i termocykeln och starta programmet.,
När programmet är klart, undersök kvaliteten på din produkt via agarosegelelektrofores, vilket tidigare visats. En lyckad reaktion med det beskrivna protokollet bör ge ett enda band på cirka 1,5 kilobas. I detta exempel gav provet innehållande 100X utspädd gDNA den högsta kvalitetsprodukten. Därefter rena den bästa PCR-produkten, i detta fall 100X gDNA, med ett kommersiellt tillgängligt kit. Nu kan PCR-produkten skickas för sekvensering.
i det här exemplet sekvenseras PCR-produkten med fram-och bakåtprimrar., Således genereras två datamängder, som var och en innehåller en DNA-sekvens och ett DNA-kromatogram: en för den främre primern och den andra för den omvända primern. Först undersöka de kromatogram som genereras från varje primer. Ett idealiskt kromatogram ska ha jämnt fördelade toppar med liten eller ingen bakgrundssignaler.
om kromatogrammen visar dubbla toppar kan flera DNA-mallar ha funnits i PCR-produkterna och sekvensen ska kasseras. Om kromatogrammen innehöll toppar av olika färger på samma plats, den sekvensering programvara sannolikt felkallade nukleotider., Detta fel kan identifieras manuellt och korrigeras i textfilen. Närvaron av breda toppar i kromatogrammet indikerar en förlust av upplösning, vilket orsakar felräkning av nukleotiderna i de associerade regionerna. Detta fel är svårt att korrigera och felmatchningar i något av de efterföljande stegen bör behandlas som opålitliga. Dålig kromatogramläsningskvalitet, indikerad av närvaron av flera toppar, uppträder vanligtvis vid de fem primära och tre primära ändarna av sekvensen. Vissa sekvenseringsprogram tar bort dessa lågkvalitativa sektioner automatiskt., Om din sekvens inte trunkerades automatiskt identifierar du fragmenten av låg kvalitet och tar bort deras respektive baser från textfilen.
använd ett DNA-monteringsprogram för att montera de två primersekvenserna i en kontinuerlig sekvens. Kom ihåg att sekvenser som erhållits med hjälp av fram-och omvänd primers bör delvis överlappa varandra. I DNA-monteringsprogrammet sätter du in de två sekvenserna i FASTA-format i lämplig ruta. Klicka sedan på Skicka-knappen och vänta på att programmet ska returnera resultaten.
för att se den sammansatta sekvensen, klicka på Contigs i fliken Resultat., Välj sedan monteringsdetaljer för att visa detaljerna i justeringen. Navigera till webbplatsen för den grundläggande lokala inriktnings sökverktyg, eller BLAST, och välj nucleotide BLAST verktyg för att jämföra din sekvens till databasen. Ange din sekvens i textrutan frågesekvens och välj lämplig databas i rullningsmenyn. Slutligen klickar du på knappen BLAST längst ner på sidan och väntar på att verktyget ska returnera de mest liknande sekvenserna från databasen.
i det här exemplet är den översta träffen B., subtilis stam 168, som visar 100% identitet med sekvensen i BLASTDATABASEN. Om den översta träffen inte visar 100% identitet till din förväntade art eller stam, klicka på den sekvens som närmast matchar din fråga för att se detaljerna i justeringen. Inriktade nukleotider kommer att förenas med korta vertikala linjer och missmatchade nukleotider kommer att ha luckor mellan dem. Fokusera på de identifierade missmatchade regionerna, revidera sekvensen och upprepa BLASTSÖKNINGEN om så önskas.