a terra é o lar de milhões de espécies bacterianas, cada uma com características únicas. Identificar estas espécies é fundamental na avaliação de amostras ambientais. Os médicos também precisam distinguir diferentes espécies bacterianas para diagnosticar pacientes infectados.
para identificar bactérias, uma variedade de técnicas podem ser empregadas, incluindo observação microscópica de morfologia ou crescimento em um meio específico para observar a morfologia da colônia., Análise genética, outra técnica para identificar bactérias tem crescido em popularidade nos últimos anos, devido em parte à sequenciação do gene Rna ribossomal 16S.
o ribossoma bacteriano é um complexo de RNA proteico constituído por duas subunidades. A subunidade 30, a menor destas duas subunidades, contém 16S rRNA, que é codificada pelo gene 16S rRNA contido no DNA genômico. Regiões específicas de 16S rRNA são altamente conservadas, devido à sua função essencial na montagem ribossoma. Enquanto outras regiões, menos críticas para funcionar, podem variar entre as espécies bacterianas., As regiões variáveis em 16S rRNA, podem servir como impressões moleculares únicas para espécies bacterianas, permitindo-nos distinguir estirpes fenotipicamente idênticas.
Depois de obter uma amostra de qualidade de gDNA, PCR do gene de codificação rRNA 16S pode começar. PCR é um método comumente usado de biologia molecular, consistindo de ciclos de desnaturação do modelo de DNA de cadeia dupla, recozimento de pares universais de primer, que amplificam regiões altamente conservadas do gene, e a extensão de primers pela DNA polimerase., Enquanto alguns primeros amplificam a maior parte do gene de codificação rRNA 16S, outros apenas amplificam fragmentos dele. Após a PCR, os produtos podem ser analisados por eletroforese em gel de agarose. Se a amplificação foi bem sucedida, o gel deve conter uma única faixa de um tamanho esperado, dependendo do par primer usado, até 1500bp, o comprimento aproximado do gene rRNA 16S.
após purificação e sequenciação, as sequências obtidas podem então ser introduzidas na base de dados BLAST, onde podem ser comparadas com as sequências rRNA de referência 16S., Como este banco de dados retorna correspondências com base na mais alta similaridade, isso permite a confirmação da identidade da bactéria de interesse. Neste vídeo, você vai observar sequenciamento do gene rRNA 16S, incluindo PCR, análise de seqüência de DNA e edição, montagem de seqüência e pesquisa de banco de dados.ao manusear microrganismos, é essencial seguir as boas práticas microbiológicas, incluindo a utilização de técnica asséptica e o uso de equipamento de protecção individual adequado. Após a realização de uma avaliação de risco adequada para o microrganismo ou amostra ambiental de interesse, obter uma cultura de ensaio., Neste exemplo, é utilizada uma cultura pura de Bacillus subtilis.para começar, cresça o seu microorganismo num meio adequado, nas condições apropriadas. Neste exemplo, Bacillus subtilis 168 é cultivado em caldo de LB durante a noite, numa incubadora agitada, fixada em 200 rpm a 37 graus Celsius. Em seguida, use um kit comercialmente disponível para isolar o DNA genômico ou gDNA de 1,5 mililitros da cultura B. subtilis overnight.
para verificar a qualidade do ADN isolado, misturar primeiro Cinco microlitros do gDNA isolado com um microlitro de Corante de carga do gel de ADN. Depois, carregue a amostra NUM 0.,8% de gel de agarose, contendo reagente de coloração de ADN, como o SYBR safe ou o EtBr. Depois disso, carregar um padrão de massa molecular de uma quilobase no gel, e executar a eletroforese até que o corante frontal é de aproximadamente 0,5 cm do fundo do gel. Uma vez que a eletroforese do gel esteja completa, visualize o gel em um transiluminador de luz azul. O gDNA deve aparecer como uma banda espessa, acima de 10 kilobase em tamanho e ter o mínimo de manchas.
Depois disso, para criar diluições seriais do gDNA, rotular três tubos de microcentrifugação como 10X, 100X, e 1000X., Em seguida, use uma pipeta para dispensar 90 microlitros de água destilada estéril em cada um dos tubos. Em seguida, adicionar 10 microlitros da solução de gDNA ao tubo de 10X. Pipetar todo o volume para cima e para baixo para assegurar que a solução é misturada cuidadosamente. Em seguida, remova 10 microlitros da solução do tubo de 10X e transfira isto para o tubo de 100X. Misturar a solução conforme descrito anteriormente. Finalmente, Transferir 10 microlitros da solução no tubo de 100X para o tubo de 1000X.para iniciar o Protocolo PCR, descongelar os reagentes necessários no gelo. Então, prepare o PCR master mix., Uma vez que a ADN polimerase está activa à temperatura ambiente, a reacção deve ocorrer no gelo. Alíquotas 49 microlitros do master misturam-se em cada um dos tubos PCR. Em seguida, adicionar um microlitro de modelo a cada um dos tubos experimentais e um microlitro de água estéril ao tubo de controlo negativo, pipetando para cima e para baixo para misturar. Depois disso, defina a máquina PCR de acordo com o programa descrito na tabela. Coloque os tubos no termociclador e inicie o programa.,uma vez concluído o programa, examine a qualidade do seu produto através da electroforese em gel de agarose, como demonstrado anteriormente. Uma reação bem sucedida usando o protocolo descrito deve produzir uma única faixa de aproximadamente 1,5 quilobase. Neste exemplo, a amostra com gDNA diluído a 100X produziu o produto de maior qualidade. Em seguida, purificar o melhor produto PCR, neste caso, o 100x gDNA, com um kit comercialmente disponível. Agora o produto PCR pode ser enviado para sequenciação.
neste exemplo, o produto PCR é sequenciado usando iniciadores dianteiros e invertidos., Assim, dois conjuntos de dados, cada um contendo uma sequência de DNA e um cromatograma de DNA, são gerados: um para o iniciador dianteiro e o outro para o iniciador reverso. Em primeiro lugar, examinar os cromatogramas gerados por cada iniciador. Um cromatograma ideal deve ter picos uniformemente espaçados, com poucos ou nenhuns sinais de fundo.se os cromatogramas apresentarem picos duplos, podem ter estado presentes vários modelos de ADN nos produtos PCR e a sequência deve ser rejeitada. Se os cromatogramas contivessem picos de cores diferentes na mesma localização, o software de sequenciação provavelmente teria rompido os nucleótidos., Este erro pode ser identificado e corrigido manualmente no arquivo de texto. A presença de picos amplos no cromatograma indica uma perda de resolução, o que provoca um erro de contagem dos nucleótidos nas regiões associadas. Este erro é difícil de corrigir e os desfasamentos em qualquer uma das etapas subsequentes devem ser tratados como não fiáveis. A má qualidade de leitura cromatográfica, indicada pela presença de picos múltiplos, geralmente ocorre nas extremidades cinco prime e três prime da sequência. Alguns programas de sequenciamento removem essas seções de baixa qualidade automaticamente., Se a sua sequência não foi truncada automaticamente, identifique os fragmentos de baixa qualidade e remova as respectivas bases do arquivo de texto.
Use um programa de montagem de ADN para montar as duas sequências primárias numa sequência contínua. Lembre-se, as sequências obtidas utilizando iniciadores dianteiros e inversos devem sobrepor-se parcialmente. No programa de montagem de ADN, inserir as duas sequências em formato FASTA na caixa apropriada. Em seguida, clique no botão enviar e espere que o programa retorne os resultados.
para ver a sequência montada, clique em Contigs na página Resultados., Em seguida, para ver os detalhes do alinhamento, selecione Detalhes de montagem. Navegue até o site para a ferramenta básica de pesquisa de alinhamento local, ou BLAST, e selecione a ferramenta de explosão nucleótido para comparar sua sequência com o banco de dados. Indique a sua sequência no campo de texto da sequência da pesquisa e seleccione a base de dados apropriada no menu deslocar para baixo. Finalmente, clique no botão BLAST na parte inferior da página, e espere que a ferramenta retorne as sequências mais semelhantes do banco de dados.
neste exemplo, o hit superior é B., subtilis estirpe 168, mostrando 100% de identidade com a sequência na base de dados BLAST. Se o hit superior não mostrar 100% de identidade para a sua espécie ou estirpe esperada, clique na sequência que corresponde mais de perto à sua consulta para ver os detalhes do alinhamento. Os nucleótidos alinhados serão unidos por linhas verticais curtas e nucleótidos inadequados terão lacunas entre eles. Concentrando-se nas regiões identificadas, reveja a sequência e repita a busca da explosão se desejar.