observação
grande parte do progresso na microbiologia depende do estudo de “culturas puras”. Estas são culturas que contêm apenas um tipo de célula, idealmente com a cultura derivada de uma única célula inicial., Desde o desenvolvimento inicial de métodos para estabelecer culturas puras (1), tem havido muitos exemplos em que culturas que foram inicialmente consideradas puras foram posteriormente encontradas para conter dois tipos de micróbios. Em alguns casos, estas culturas inadvertidas de várias espécies levaram a importantes avanços, como a descoberta da transferência interespécie de hidrogênio (2). No entanto, com o advento de tecnologias de sequenciamento profundo, poderia razoavelmente prever-se que contaminantes não detectados nas culturas não seriam mais uma preocupação significativa.,
geobacter sulfurreducens estirpe PCA foi isolada em meados da década de 90 através da utilização de técnicas padrão de enriquecimento e Isolamento que incluíram a diluição até à extinção em meio líquido, seguidas de várias estrias de colónias isoladas em meio solidificado com ágar (3). Esta é a estratégia clássica ensinada nos livros de Microbiologia introdutórios mais populares (4-6). Mais tarde, a estirpe DL1 de G. sulfurreducens foi obtida por recauchutagem adicional de colónias isoladas de PCA (7). Com o desenvolvimento de métodos para a manipulação genética de G. sulfurreducens (7) e a sequenciação de seu genoma (8), G., sulfurreducens became the Geobacter species of choice for the study of the physiology and novel extracelular electron transfer properties of this environmentally important genus (9). A sequenciação inicial do gene rRNA 16S na cultura (3), bem como a sequenciação do genoma primeiro para 8 vezes (8) e depois para 80 vezes (10, 11) cobertura, indicou que a cultura continha apenas uma estirpe.,
numa tentativa de evoluir adaptativamente DL1 para produzir mais corrente, foi inoculado num sistema bioelétrico com um ânodo de grafite perfurado a um potencial (-400 mV versus Ag/AgCl) considerado próximo do limite mais baixo a que seria possível a geração actual de acetato (12). Um isolado obtido do biofilme do ânodo, designado G., sulfurreducens KN400 (12), é superior para o inóculo de deformação na produção de corrente elétrica, e esta superioridade é atribuída, pelo menos em parte, à sua capacidade para produzir mais “microbiana nanofios,” eletricamente condutora de proteína de filamentos que apresentam metalizado-como condutividade elétrica (13, 14).foi inicialmente assumido que a estirpe KN400 tinha acumulado uma ou mais mutações que aumentavam a sua capacidade de transferência electrónica extracelular., Isto seria análogo à selecção de estirpes mutantes durante a evolução adaptativa da estirpe DL1 para troca electrónica com outros organismos (11) ou taxas mais elevadas de redução do óxido Fe(III) (10). No entanto, a genómica comparativa revelou que a sequência genómica da estirpe KN400 continha mais de 27.270 polimorfismos nucleótidos únicos (SNPs) (15). Um terço dos genes tinha pelo menos um polimorfismo nucleotídeo, e um quarto tinha um polimorfismo que afetou a sequência proteica resultante (15). Baseado em taxas de mutação típicas de 6.,3 × 10-9 / bp por geração (16), levaria mais de 1000 anos para acumular estas muitas mutações na estirpe DL1. Além disso, não existem ortólogos na estirpe DL1 para 139 dos quadros de leitura aberta (ORFs) no genoma da estirpe KN400, a maioria dos quais estão mais intimamente relacionados com genes em organismos filogeneticamente diversos (15).
estas considerações e o facto de os ORFs únicos ao KN400 não terem sido detectados quando a cultura de inóculo foi ressequenciada (10, 11) levaram à hipótese de que o KN400 entrou no sistema bioelectroquímico como um contaminante., Para avaliar esta possibilidade, a pureza da cultura DL1 foi ainda avaliada com maior sensibilidade.
tanto DL1 como KN400 contêm omcS, um gene para um citocromo de superfície exterior que tem uma das maiores proporções de SNPs (36 SNPs/kb) entre as duas estirpes (15). Este gene foi amplificado a partir da cultura DL1 que tinha sido usada para inocular o sistema bioelectroquímico ,e os produtos PCR foram sequenciados com Illumina Hi-Seq 2000 (ver texto S1 no material suplementar)., A sequência KN400 foi detectada, indicando que o KN400 estava presente no inóculo inicial utilizado para o estudo de selecção do ânodo. No entanto, do id
107 sequências de alta qualidade recuperadas, apenas 286 foram sequências KN400 versus 1.5 × 107 sequências DL1 (Tabela 1).
texto S1
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as Estimativas de tensão KN400 abundância em vários culturesa
Tabela S1
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A abundância relativa dos KN400 tensão nesta mesma cultura foi avaliada por PCR quantitativo (de acordo com pcr) com um conjunto de primers específicos para o gene é encontrado apenas em KN400 (ver Texto S1 e Tabela S1 no material suplementar) e um conjunto de primers que detectado tanto KN400 e DL1 (ver Tabela S1 no material suplementar)., A abundância relativa da sequência específica do KN400 foi semelhante à das sequências OMCS do KN400 determinadas pela abordagem sequenciadora (Tabela 1). A análise da sequência e o ensaio qPCR da cultura de APC depositada na ATCC revelaram a presença de KN400 a uma baixa abundância semelhante (Tabela 1).tentámos remover o raro contaminante KN400 da cultura DL1 através de repetidos reexpressões de colónias isoladas cultivadas em meio solidificado acetato-fumarato (7), mas a estirpe KN400 continuou a persistir a uma baixa frequência nas colónias isoladas (Quadro 1)., No entanto, foi obtida uma cultura em que o KN400 já não podia ser detectado em meio acetato-fumarato líquido (ver texto S1 no material suplementar), na qual a diluição mais elevada que exibia crescimento foi sujeita a várias rodadas sucessivas de diluição em série (Quadro 1). Isto demonstrou que a estirpe DL1 não requer a presença rara de KN400 para crescer no meio acetato-fumarato no qual esta cultura é mantida rotineiramente.quando o KN400 puro e a cultura DL1 livre de KN400 foram inoculados em meio acetato-fumarato em quantidades iguais, o KN400 superado por DL1 (Fig., 1a). Isto é consistente com a conclusão de que quando as duas estirpes foram cultivadas separadamente, DL1 cresceu muito mais rápido do que KN400 (densidade óptica a 600 nm de 0,04 para KN400 versus 0.65 para DL1 após 36 h de incubação; ver Fig. S2 no material suplementar) no mesmo meio. A proporção de KN400 continuou a diminuir com transferências consecutivas (1% de inóculo) até que a abundância de KN400 era comparável à das culturas de estoque PCA e DL1 (ver texto S1 no material suplementar). KN400 persistiu neste nível baixo com novas transferências (Fig. 1a).,
Figura S2
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crescimento e actividade da estirpe KN400 em diferentes condições de crescimento. a) abundância relativa de KN400 em sucessivas transferências intermédias de log (1% de inóculo) de uma cultura iniciada com proporções iguais de KN400 e DL1. Os resultados são os meios e os desvios-padrão das culturas triplicadas. b) a produção actual quando a cultura DL1 foi introduzida na câmara anódica de um sistema bioelectroquímico com um ânodo de grafite perfurado a -400 mV versus Ag/AgCl. A cultura sem KN400 não produziu nenhuma corrente ao longo deste tempo., c) abundância relativa de KN400 em biofilmes anódicos, quando o inóculo inicial foi a cultura DL1 que posteriormente se verificou conter também KN400. Os resultados são os meios e os desvios-padrão das culturas triplicadas.
tentativas repetidas de fazer crescer a cultura DL1 livre de KN400 num ânodo perfurado a -400 mV não foram bem sucedidas. No entanto, a corrente foi prontamente produzida em outro conjunto de experimentos em que a cultura DL1 contendo KN400 serviu como inóculo (Fig. 1b)., Um ensaio qPCR do ADN extraído do biofilme do ânodo indicou que 100% das sequências omcS eram KN400 na segunda transferência (Fig. 1c). Estes resultados sugeriram que a razão pela qual o KN400 surgiu nos ânodos era que a estirpe DL1 não era capaz de crescer nas condições impostas. Sem esta pressão seletiva incomum, KN400 teria permanecido indetectável nas culturas PCA e DL1, mesmo por métodos de sequenciação de próxima geração atualmente disponíveis que podem teoricamente fornecer uma cobertura milésima na sequenciação do genoma.,os factores que contribuem para a persistência a longo prazo da estirpe KN400 com uma frequência extremamente baixa na cultura DL1 permanecem um mistério. A importância de isolar fisicamente células únicas por métodos mais definitivos do que correr em meio sólido para estabelecer culturas puras tem sido reconhecida por algum tempo (17), e métodos cada vez mais sofisticados para realizar isso continuam a ser desenvolvidos (18-23)., No entanto, os métodos de revestimento que estão em uso há mais de 100 anos e são ensinados a todos os estudantes de Microbiologia como procedimentos padrão para a obtenção de culturas puras (4-6) continuam a ser os mais comuns. Os resultados aqui apresentados demonstram que, sem isolamento de células únicas, contaminantes crípticos podem sobreviver a uma frequência muito baixa em culturas ao longo de décadas de investigação intensiva e podem escapar à detecção mesmo pelos métodos de sequenciamento mais sofisticados atualmente disponíveis.,
figura S1
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