3.1.2.2. HPLC
HPLC usando fases móveis à base de acetonitrilo ou hexano permite a detecção direta de fosfolípidos sem limpeza prévia do extrato bruto, tornando estes métodos simples e rápidos. Contudo, estes métodos não separam eficazmente os diferentes fosfolípidos de inositol. Nakamura et al. (1989) have developed an HPLC procedure that specifically analyzes PtdIns and PtdInsP2 in the brain., Neste método, o extrato lipídico é o primeiro derivadas com 9-anthryldiazomethane para produzir (9-antril) PtdInsP e di(9-antril) PtdInsP2 e, em seguida, as derivadas da amostra é separada por HPLC com detecção UV em 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn e SM não são derivadas com este reagente e, portanto, não interferem com o ensaio (Yamada et al., 1988). Este método é mais sensível do que o método de detecção de UV subivatizado para a análise dos fosfolípidos de inositol.
Low (1990) has described the use of DEAE cellulose columns for preparative HPLC of brain lipids., Os fosfolípidos cerebrais dissolvidos em 50 ml de solvente a (clorofórmio/metanol/H2O, 20:9:1, por vol.) e aplicada à coluna de celulose (DEAE celulósica, Sigma), que é lavada com álcali e ácido para a neutralidade. A DEAE lavada é embalada numa coluna de vidro (2 cm × 38 cm) com acessórios resistentes a solventes. A coluna é então eluída a um caudal de 100 ml / h com 1 gradiente linear de 100% do solvente a para 100% do solvente B (solvente a contendo 0,6 M acetato de amónio) e recolhem-se fracções de 13-15 ml para determinação do fósforo (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolamento de PtdInsPs do cérebro bovino por cromatografia em coluna DEAE-celulose. A fracção do Folco precipitado com metanol lavado com ácido foi eluída a partir de uma coluna DEAE-celulose com um gradiente de 100% de solvente A (clorofórmio/mefhanol/H2O, 20:9:1, por vol.) a 100% do solvente B (solvente a contendo acetato de amónio de 0,6 M) e fracções de 13-15 ml recolhidas. As fracções foram marcadas para fósforo orgânico. A recuperação média do fósforo orgânico aplicado foi de aproximadamente 90%., O pico de eluição no número da fracção. Vinte e cinco estavam reprodutivelmente presentes, mas não foram identificados. A composição dos Picos foi determinada pela análise TLC das fracções agrupadas. Os picos são identificados como mostrado na figura.
Reproduced from Low (1990) with permission of publisher.
Alternatively, Low (1990) performed the chromatographic step by preparative HPLC using an amino column. Os fosfolípidos cerebrais foram dissolvidos em 5 ml de solvente a e foram aplicados a um caudal de 2.,5 ml/min para 10 mm × 250 mm amino-coluna NP (5 µm esféricas de sílica com n-propilamina obrigar fase, IBM Instrumentos, Danbury, CT), com 4,5 mm × 50 mm protetor de coluna equilibrada com Solvente A. A coluna é eluídas a uma vazão de 2,5 ml/min com 25 ml de Solvente A, 125 ml de gradiente de 100% de Solvente de Um para 100% de Solvente B, e 100 ml de 100% de Solvente B; 5 ml de frações coletadas. Concentram-se as fracções agrupadas ajustando-as para 18 ml com o solvente a e extraindo os fosfolípidos. A recuperação média de fósforo orgânico é de 80%., Obteve-se uma separação completa das Ptdinas (90 ml), PtdInsP (150 ml) e PtdInsP2 (160-200 ml) (cromatograma não apresentado). Os PtdIns, no entanto, sobrepõem-se aos PtdSer. A composição dos Picos foi determinada com TLC de fracções agrupadas.
ow (1990)has also described an HPLC purification of the-labeled PtdIns(4)P and PtdIns(4,5) P2 from human platlet. O extrato lipídico de plaquetas foi preparado a partir de 60 ml de sangue humano fresco na presença de metanol precipitado PtdInsPs do cérebro bovino como um portador, é finalmente redissolvido em 0.,5 1 de Solvente A e aplicado a uma taxa de fluxo de 1 ml/min, e um máximo de 4,5 mm × 250 mm amino-NP coluna equilibrada à base de Solvente, A. A coluna é eluídas com 5 ml de Solvente A (25 ml gradiente linear de 100% de Solvente de Um para 100% de Solvente B), e 20 ml de Solvente B. Um mililitro frações são coletados e a radioatividade determinada pela contagem por cintilação líquida. A recuperação média da radioactividade aplicada é de aproximadamente 70%. Há uma excelente resolução dos três fosfatídeos de inositol, mas as Ptdinas sobrepõem-se ao PtdOH., Portanto, este procedimento HPLC não é adequado para a preparação de PtdIns desde PtdOH, que na maioria dos tipos de células é mais rapidamente rotulado por Pi, não é resolvido a partir dele. É provável que outros fosfolípidos aniónicos, como o PtdSer, sejam mal resolvidos das Ptdinas pela coluna amino-NP, como observado com o procedimento DEAE-celulose.tal como acima referido, Nenhum dos métodos acima referidos é eficaz na separação dos PtdInsPs individuais, em forma pura, dos extractos de tecidos brutos. Por conseguinte, os extractos lipídicos devem ser processados por várias etapas cromatográficas., Para este efeito, o extracto é submetido pela primeira vez a cromatografia Sephadex para separação dos lípidos dos não-glípidos do extracto. Verte-se então a fracção lipídica sobre uma coluna DEAE que é eluída com solventes diferentes. Os PtdInsPs são recuperados por eluição com clorofórmio/metanol/sal de amónio como a fase final de eluição. As fracções individuais concentram-se em 100 µl a 45°C em azoto e, em seguida, o resíduo concentrado é separado por cromatografia em cartucho-coluna, TLC, HPLC ou outros procedimentos cromatográficos.,Singh(1992)descreveu a extracção e análise de Ptdinas, PtdIns(4)P e PtdIns(4,5) P2 utilizando um cartucho Sep-Pak. Um extracto lipídico total (Folch et al., 1957) de ratos cérebro synaptosomes e microvessels primeiro foi preparado e a primeira fração gerada (Fração 1) foram coletadas e mais extraídos para separar os fosfolipídeos e glicolipídeos, como descrito por Dugan et al. (1986). A fracção fosfolípida foi submetida a cromatografia DEAE-celulose (sequência de separação 4), tal como descrito por Rouser et al. (1969) to purify further the inositol lipids., O extracto purificado foi transferido para um cartucho Sep-Pak. Vários inositol lipídios são eluídas da coluna com um gradiente linear de acetato de amônio e água de 0,5% de acetato de amônio (200 mM) e 99,5% de água a 75% de acetato de amônio e 25% de água em 60 min a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min (ver Capítulo 2). A coluna eluída durante 120 minutos foi recolhida em fracções de 1 ml. Foram identificados diferentes picos utilizando os picos PtdIns, PtdIns(4)P e PtdIns(4,5)P2 como pontos de referência., As fracções contendo lípidos inositol individuais foram agrupadas e analisadas por HPLC, tal como descrito por Geurts van Kessel et al. (1977). Os fosfolípidos individuais foram detectados a 206 nm usando um detector de díodos programado para escanear um intervalo de 200-350 nm. Singh (1992) demonstrou 50-90% de recuperação de PtdIns e InsPs de amostras do cérebro. InsP3 e InsP4 exibiram a menor recuperação por causa da má quantificação ao invés de um método de extração pobre. Os métodos do cartucho não foram aplicados para o isolamento das Ptdinas(3)P, Ptdinas(3,4)P2 e Ptdinas (3,4,5)P3.Cronholm et al., (1992) descreveram o isolamento dos PtdInsPs do pâncreas de rato. Cada pâncreas foi imediatamente homogeneizadas em 3 ml de clorofórmio/metanol (1:2, v/v), e cerca de 3 MBq de 3H-rotulado PtdIns(4)P ou PtdIns(4,5)P2 foram adicionadas, juntamente com 0,6 ml de 1,2 aq. HCl antes da extração com clorofórmio, como descrito por Schacht (1981). O metanol foi adicionado aos extractos combinados e lavados para produzir clorofórmio/metanol (3:2, v/v). A solução foi aplicada na coluna Lipidex-DEAE, e a maioria dos lípidos foram eluídos com clorofórmio/metanol (3:2, v/v) ou clorofórmio/metanol/água (3:6:1 por vol.)., PtdIns e PtdSer foram eludidos juntamente com 0,03 M H3PO4 e material não identificado com 0,1 M H3PO4. As ptdinas(4)P foram eludidas com 0, 25 M H3PO4 e Ptdinas(4,5)P2 com 0, 5 M H3PO4, conforme indicado pela radioactividade eluída. Todas as fracções foram extraídas com 0, 4 ml de água / ml de eluato. A fase superior foi extraída de volta com 0,1 vol. de clorofórmio. As fases combinadas de clorofórmio foram lavadas com 0, 4 vol. de 0,5 M HCl em 50% aq. metanol. As frações foram utilizadas para a determinação de espécies moleculares por FAB/MS (ver abaixo).Gunnarsson et al., (1997) used normal phase HPLC with evaporative light scattering detection for the analysis of commercial samples of PtdInsPs along with other phospholipids. Utilizando um gradiente linear de a, clorofórmio / metanol / amoníaco (50: 45: 3, em vol.) and B, clorofórmio/metanol / água / amoníaco (25: 55: 17: 3, by vol.) foram obtidos picos emergentes tardios relativamente aos PtdIns (4)P e PtdIns(4,5) P2. As curvas de resposta à dose para Ptdinas (4)P e Ptdinas(4,5) P2 não foram lineares, o que é uma característica do detector de espalhamento de luz (resultados não apresentados)., Para a maioria das finalidades, a técnica de HPLC é superior em resolução, velocidade e conveniência geral ao procedimento DEAE-celulose e é o método de escolha se o equipamento de HPLC estiver disponível. A DEAE-celulose é barata e a purificação em larga escala pode exigir o uso deste material. O procedimento HPLC é também superior a alguns ou em todos os aspectos a procedimentos alternativos para a purificação de polifosfoinositidas, por exemplo, cromatografia de afinidade de TLC ou de neomicina.