Introdução
Âmbar, um conhecido produto natural do cachalote , que é também encontrado como refugo nas praias de todo o mundo , e tem sido altamente valorizada por sua utilidade na indústria de perfumes . Embora há muito tempo tenha sido afirmado que o jetsam ambergris coletado em praias se origina de cachalotes , pouca ou nenhuma evidência para isso já foi publicada, e existem distinções entre essas amostras e amostras de ambergris diretamente tomadas de cachalotes., Por exemplo, as amostras de jetsam ambergris geralmente contêm proporções muito mais elevadas do álcool triterpenóide ambreina e proporções muito mais baixas de esteróis do que as amostras de ambergris de cachalotes . Inversamente, embora, jetsam ambergris às vezes contém fragmentos de bicos de Lula , e desde cefalópodes, como a lula, constituem o principal componente dietético de cachalotes, este tem sido citado como evidência de uma origem dos coprolitos de jetsam de cachalotes. É até mesmo teorizado ambergris pode ter origem como uma secreção patológica do irritante do bico-de-Bico-Duro ., No entanto, outras espécies de mamíferos marinhos (por exemplo , membros de Globicephala e Ziphiidae) também são anteriores à Lula, e algumas (incluindo baleias-anãs e espermatozóides-pigmeus) também são citadas como potenciais fontes de ambergris . Assim, para elucidar ainda mais a origem do jetsam ambergris, analisámos o ADN de uma amostra de ambergris colhida de um cachalote encalhado nos Países Baixos e comparámo-la com sequências de ADN isoladas do jetsam ambergris recolhidas nas praias da Nova Zelândia e do Sri Lanka.,o Ambergris é predominantemente composto por ambreina devido à sua produção de esqualeno, um produto metabólico comum em muitos organismos . Este processo pode ser induzido pela influência microbiana intestinal, e precipita em densas massas sólidas dentro do cólon da baleia . As acreções coprolíticas que resultam são composicionalmente adequadas para preservar o DNA do cólon, Uma vez que a ambreina é hidrofóbica e aparentemente resistente à degradação dentro do ambiente ácido entérico., Evidências da datação por radiocarbono certamente indicam resistência à microbiana e à foto-degradação no meio marinho por até um milênio em algumas amostras de jetsam ambergris . Hipotetizamos que tal material poderia fornecer um esconderijo oportuno para preservar o DNA, mesmo após exposição prolongada a condições prejudiciais no mar.foram analisados materiais e métodos de Jetsam ambergris do mar do Norte, do Oceano Índico e do Pacífico, representando a distribuição global do material ., Três espécimes de jetsam ambergris (um do Sri Lanka, dois da ilha Pitt, Nova Zelândia) foram submergidos para extração de DNA. Um quarto espécime originou-se da dissecação de um cachalote macho em dezembro de 2012, em Razende Bol, perto de Texel, nos Países Baixos. Este último âmbar “fresco”, de uma carcaça confirmada de cachalote, forneceu uma comparação conhecida com os espécimes de jetsam com história biológica não confirmada. Foram obtidos e analisados espécimes de ambergris para pesquisa do teor de ambreina e esterol fecal em estudos anteriores .,a extração e sequenciação do DNA foram realizadas no GLOBE Institute, Universidade de Copenhague, em um laboratório de DNA antigo dedicado seguindo procedimentos rigorosos para a minimização da contaminação. Aproximadamente 120 mg foram subamostrados (Figura 1 e quadro 1) para extração de ADN. As amostras foram incubadas em tampão proteinase K contendo 400 µl após Gilbert et al. a 56 ° C durante 10 h; os sobrenadantes foram então tratados utilizando um fenol–clorofórmio após Carøe et al., e purificado usando colunas de limpeza de DNA Monarch (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) de acordo com as diretrizes do fabricante. Bibliotecas de cadeia dupla foram construídas a partir de extratos de DNA seguindo o melhor protocolo , Projetado e provado especificamente para sequenciamento de DNA antigo e degradado. As bibliotecas foram amplificadas e indexadas através do PCR usando PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) de acordo com as diretrizes do fabricante., Os produtos foram agrupados na concentração equimolar antes da sequenciação em uma plataforma Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, EUA), usando 80 bp single end read chemistry no centro nacional dinamarquês de sequenciamento de DNA de alto rendimento, Copenhague, Dinamarca.
Figura 1. Dados relativos às amostras de ambergris analisadas. (a) mapa mostrando as localidades onde foram originalmente encontradas amostras ambergris., B) fotografias que mostravam uma grande diversidade nas características físicas dos fragmentos de ambergris: TEXEL151212 (de espécimes de baleias dissecadas) era granulado em consistência, enquanto amostras de jetsam apareciam superficialmente mais densas e heterogéneas, e eram internamente equigranulares e significativamente mais pálidas em cor.
| exemplo | localização | massa total (g) | analisadas massa (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Ilha, Nova Zelândia | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | do oeste do Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Holanda | 83000 | 92 | 93 |
| exemplo | total retido lê | média retida comprimento de leitura (bp) | total alinhado lê (dnamt) | tempos de cobertura (dnamt) | total alinhado lê (genoma inteiro) | tempos de cobertura (genoma inteiro) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
a análise da Sequência foi realizado em alto desempenho, facilidade de computação na Universidade de Copenhaga, com FASTQ arquivos processados utilizando o PALEOMIX pipeline (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 foi inicialmente usado para controle de qualidade de dados de sequência bruta. Adaptadores foram aparados usando AdapterRemoval v. 2.3.1, com leituras inferiores a 25 bp também removidas. As leituras foram então mapeadas para sequências de referência usando BWA, também aplicando mapDamage2.,0 para a quantificação básica da degradação, produzindo alinhamentos com sequências de referência. ANGSD foi então usado para produzir sequências em formato FASTA.
A incerteza em torno da origem e os mecanismos biológicos para a produção de ambergris levou-nos a considerar várias possíveis espécies candidatas de cetáceos e piniped em análise sequencial. A identidade das espécies foi inferida pelo mapeamento de sucesso e relação filogenética com 19 espécies candidatas de cetáceos e pinípedes em NCBI RefSeq (veja o material suplementar eletrônico)., Estas espécies foram selecionadas com base na potencial adequação como mamíferos marinhos de mergulho profundo preenchendo um nicho ecológico semelhante aos cachalotes, para descartar que tais espécies sejam co-adaptadas para produzir âmbar. Sequências de amostras foram concatenadas e alinhadas usando MAFFT v. 7.392 . Modelos filogenéticos de árvores foram então produzidos em MEGA X usando o método de máxima probabilidade com o modelo Hasegawa–Kishino–Yano, com distâncias estimadas pela máxima aproximação de probabilidade composta (detalhes de todas as sequências de referência utilizadas são incluídos no material suplementar eletrônico).,
resultados
as análises filogenéticas apoiaram inequivocamente a origem dos cachalotes das quatro amostras ambergris (Figura 2; material suplementar electrónico, figura S1). Da mesma forma, o alinhamento com o genoma de referência mitocondrial Physeter macrocephalus do NCBI (NC_002503.2) produziu os resultados de cobertura mais elevados para todas as amostras de todos os alinhamentos feitos e fornece uma atribuição confiante, embora com variações significativas no sucesso entre as amostras. Sequenciamento da amostra de um cachalote encalhado (TEXEL151212) produzido de longe a maior cobertura (aprox., 20×) para a mitocôndria de cachalote, enquanto uma das amostras de jetsam da ilha Pitt (s. 01) apenas rendeu cerca de 0,2× cobertura (Ver Tabela 2). Alinhamentos com Kogia sima (anã baleia cachalote) e Kogia breviceps (cachalote pigmeu) referência genomas mitocondriais (NC_041303.1, NC_005272.1) também rendeu cobertura (detalhes em eletrônica de material complementar), apesar de muitos altamente conservadas regiões funcionais são compartilhados entre as espécies analisadas, resultando em uma alta semelhança entre sequências . No entanto, a cobertura para espécies kogiidas era tipicamente em torno de um fator de 10 menos do que para Physeter., O alinhamento com o genoma de referência nuclear de P. macrocephalus (ASM283717v2) também foi bem sucedido, embora isso seja mais evidente em comparações do número total de leituras mapeadas para o genoma. O alinhamento para Architeuthis dux (lula gigante), uma famosa presa comum de cachalotes (por exemplo ), não foi bem sucedido, mas esta não é a sua presa predominante .
Figura 2. Maximum-likely phylogenetic tree model generated from reference sequences and aligned sample mitochondrial genomes., As amostras estão claramente situadas em grupos com cachalotes (P. macrocephalus) em vez de cachalotes anões e Pigmeus (Kogia spp.). Esta árvore reflete o modelo de maior probabilidade logarítmica, os valores refletem a porcentagem de árvores computadas nas quais os taxa associados foram agrupados, indicando confiança no posicionamento, e os comprimentos dos ramos medem o número de substituições em cada local (ver escala). Figura produzida em MEGA X. Representações de baleias de:https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Uma árvore filogenética, incluindo todas as 19 espécies candidatas, é apresentada em material suplementar eletrônico, figura S1.
Resultados da MapDamage mostrar notavelmente pouco inter-exemplo de variação que afetam C a T transições no 5 “vertente termina, apesar de um percentual maior de G para Um transições de 3′ final existe para S. 01 (detalhes em eletrônica de material complementar, a figura S2), indicando possíveis superior biomolecular de degradação., Geralmente, no entanto, muito pouca modificação química ocorreu, e a distribuição de alterações entre os fios permanece uniforme e plana.
discussão
Este estudo demonstrou que três amostras de jetsam ambergris podem ser confiantemente atribuídas a cachalotes através da extração de ADN. Embora a confirmação de uma origem de cachalote para jetsam ambergris não seja um resultado surpreendente, o presente estudo é o primeiro em fornecer uma prova significativa de conceito para recuperar o DNA endógeno de ambergris e usá-lo com sucesso para a identificação do organismo., Importante é que a origem das três amostras de jetsam ambergris aqui estudadas pode ser identificada com confiança como cachalote, com base não apenas no sucesso do alinhamento genético, mas também na modelagem de genomas mitocondriais em árvores filogenéticas de parentesco, incluindo para uma grande amostra de táxons de mamíferos marinhos fora do grupo., No entanto, apesar de todas as amostras analisadas aqui terem sido identificadas como sendo originárias de cachalotes, ainda é possível que outros mamíferos marinhos de mergulho profundo (como os cachalotes anões e Pigmeus) possam produzir ambergris e simplesmente ainda não tenham sido registrados como fazendo isso até à data.não é clara a causa predominante da variação dramática da cobertura genética observada entre as amostras. Análise da degradação do ADN em mapDamage2.,0 mostra pouca correlação com as coberturas de alinhamento, como seria de esperar, e também há pouca variação entre o conteúdo de ambreina em amostras que poderiam contribuir para a preservação diferencial do DNA. A idade precisa das amostras de jetsam presentes é desconhecida, embora estudos anteriores tenham tido sucesso com radiocarbono datado de outras amostras de ambergris . No entanto , a datação por radiocarbono de amostras relativamente recentes é problemática devido ao impacto das emissões de combustíveis fósseis, e as datas de radiocarbono desde o aumento da liberação de carbono antropico não são confiáveis., Produzir uma taxa de degradação consistente de G para transições em amostras antigas com datas confiáveis pode, no futuro, ajudar a uma melhor compreensão dos danos diferenciais do ADN. Outra opção para pesquisas futuras pode ser Estudos de desamidação de glutamina e racemização de ácido aspártico a partir da análise de peptídeos orgânicos possivelmente também presente em ambergris . Em alternativa, no entanto, a variação intra-amostra na concentração de ADN e ambreina pode igualmente justificar uma baixa cobertura na amostra S.,01, enquanto a exposição mais recente ao tecido de cachalote sem dúvida é responsável pela alta cobertura na amostra de baleia encalhada TEXEL151212.
o potencial conservante de ambrein precipitados para o ADN estende-se não apenas à genética endógena da baleia, mas também à cobertura metagenómica do microbioma intestinal da Baleia, e potencialmente também ao ADN da sua presa. Por exemplo , o DNA também pode permanecer dentro de bicos de Lula parcialmente ou não digeridos encontrados em fezes de cachalote , e em ambergris, que são até teorizadas como uma causa patológica de secreção de âmbar ., A compreensão da composição procariótica do ambiente microbiológico em ambergris poderia também elucidar ainda mais a origem de ambergris, particularmente na conversão de esqualeno em ambreina e no processo pelo qual ambergris parece formar-se em camadas de acreção. Outras análises sobre a recuperação endógena de DNA a partir de jetsam ambergris, incluindo também o DNA de microbiota e presa do intestino de baleia, produziriam percepções significativamente maiores sobre a ecologia, evolução e metabolismo de cachalotes.,Jetsam ambergris tem sido um material enigmático, sujeito a discussão e análises em publicações científicas desde o século XVIII. Este estudo é o primeiro do nosso conhecimento a apresentar a confirmação final da origem biológica das amostras de jetsam ambergris como cachalotes, através da análise do ADN. Além disso, no entanto, o presente estudo estabelece o potencial de ambergris como uma nova fonte de dados genéticos relacionados com cachalotes com uma longevidade considerável ao longo do tempo., O estudo das condições de conservação do ADN na ambreina e dos efeitos diferenciais de múltiplos factores ainda não permitiu obter uma maior elucidação. No entanto, as implicações potenciais para ajudar a nossa compreensão da dinâmica populacional passada em baleias e seus táxons ecologicamente associados podem ser profundas. Os mais antigos âmbar conhecidos encontrados nos depósitos do Pleistoceno apresentam bicos de Lula permineralizados contendo aminoácidos endógenos à Lula, que os autores atribuem à capacidade de conservação do sedimento local ., Embora seja improvável que o ADN seja preservado para esta idade (1, 75 Ma), esta descoberta pode também ser atribuída à eficácia do ambergris e da ambreina como substratos conservantes. Uma grande parte ainda é desconhecida sobre a ecologia e adaptação dos Gigantes marinhos anteriormente caracterizados como bestas semi-míticas, e ambergris pode agora provar uma pequena, mas significativa chave para entender alguns outros aspectos deles.todas as amostras foram obtidas e analisadas eticamente neste estudo, parte do projeto PROTEIOS DNRF-128., Dos quatro âmbar amostras analisadas neste estudo, três (S. 01–S. 03) foram subsampled do material estudado por S. J. R. antes de publicações (ver acima), obtido como refugo âmbar encontrado em praias (exemplo nos ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 e ACL237-S. 03). A quarta amostra (TEXEL151212) foi gentilmente fornecida como uma subamostra do espécime ambergris TEXEL151212 pelo Dr. A. Oosterbaan em nome do Museu EcoMare, Texel, nos Países Baixos, onde o resto da amostra ainda é mantida. Agradecemos a permissão do museu para usar esta amostra.,
acessibilidade de Dados
contribuições dos Autores
interesses Concorrentes
declaramos que não temos interesses concorrentes.
financiamento
financiamento foi concedido pela Fundação Nacional de investigação Dinamarquesa grant PROTEIOS (DNRF128).
agradecimentos
R. M. está grato ao Dr. J. A. Samaniego por conselhos sobre análises genómicas, e também a M. McCarthy por conselhos e discussões. Estamos gratos ao Dr. A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) pela amostra s. 04 e aos coletores anônimos pelas amostras S. 01–s. 03., Os autores gostariam de reconhecer a assistência do centro nacional dinamarquês de sequenciação de alto rendimento na geração de dados Illumina.
notas
material suplementar electrónico está disponível em linha em https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
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