Telômero relação estrutura — Função
Como já mencionado, na ausência de telomerase, os telômeros se tornar não-funcionais, encurtar com sucessivas divisões celulares e os cromossomas termini pode fundir, como consequência de proteção. As perfusões de telômero são o resultado da junção final não homóloga (NHEJ), que é um dos mecanismos prevalecentes de uma cura de ruptura dupla de cadeia (DSB)., O resultado de tais eventos Pode ser a criação de cromossomos com mais de um centrômero, que provavelmente serão agrupados para pólos opostos durante a mitose, resultando em quebra cromossômica e maior instabilidade genômica através de repetidos eventos de fusão – quebra. Em vertebrados, o papel da proteção final cromossômica para ser distinguido das quebras cromossômicas é atribuído a um complexo específico de proteínas coletivamente referidas como shelterina. O complexo de shelterina é basicamente composto por seis proteínas., Dois membros do complexo shelterin, TRF1 e TRF2 (de Telomere Repeat-binding Factor 1 e 2) ligam-se diretamente à sequência telomérica de cadeia dupla, enquanto POT1 liga-se a ssDNA. O TRF2 interage com e recruta o RAP1, enquanto o TIN2 mediata a ligação TPP1 – POT1 ao complexo central TIRF1 / TIRF2. POT1 liga – se a e protege o “overhang” de DNA de cadeia única de telómeros (cauda-G), Enquanto o TIN2 provavelmente liga os complexos de ligação de DNA de cadeia simples e dupla, especialmente na área da formação telomérica de laço-D (Figura 3) ., Parece que este núcleo shelterin complexo está localizada principalmente no final dos telómeros (também referido como telosome) e serve tanto para a estabilização t-loop estrutura, protegendo-o ao mesmo tempo de ser reconhecido como danos ao DNA e reparado por NHEJ. Além disso, a shelterin regula o acesso aos processos de restauração do DNA telomérico após cada replicação do genoma., Em geral, o complexo shelterin parece funcionar como uma plataforma que regula o recrutamento de uma crescente lista de fatores envolvidos na remodelação cromatina, replicação de DNA, reparação de danos ao DNA, recombinação e função telomerase, regulando assim o acesso telômero / modificação por diversos processos celulares (Figura 4), recentemente revisado em .
Figura 3.
modelo esquemático de potencial disposição de cobertura telomérica pelo complexo shelterin., As proteínas do complexo shelterin participam na proteção telomere, replicação e regulação do comprimento. As proteínas TRF1 e TRF2 ligam-se especificamente ao ADN telomérico ds, enquanto o POT1 (TPP1) reconhece o ssDNA (estabilizando o Ciclo-D). TIN2 interconecta ssDNA a complexos de ligação dsDNA, estabilizando a estrutura de telossomos. O DNA telomérico consiste em sequência repetitiva de DNA, uma região duplex e um overhang ssDNA g-strand (G-strand, laranja; C-strand, azul). O complexo shelterina liga–se às regiões duplex e ssDNA através de interacções proteínas-ADN específicas., A formação do T-loop envolve a invasão do G-overhang para criar um loop-deslocamento (D-loop). O laço-t é proposto para mascarar a extremidade do cromossomo a partir de sensores de danos de DNA. Por razões de simplicidade, o complexo shelterin é descrito como um complexo de seis proteínas disperso homogeneamente em telomere. Ver texto para mais detalhes.
Curiosamente, parece que mais do que um tipo de núcleo shelterin complexo existe e nem todos eles são, necessariamente, parte do telosome. Foram detectados complexos contendo apenas TRF1-TIN2-TPP1-POT1 ou TRF2-RAP1., Dados recentes que medem as quantidades absolutas e relativas de TRF1 e TRF2 na célula revelaram que o TRF2 é cerca de duas vezes mais abundante do que o TRF1, o que é consistente com o TRF2 ser detectado em focos induzidos por danos no ADN direccionados espacialmente em regiões cromossómicas não-teloméricas. O Recrutamento do TRF2 para locais de danos ao ADN é consistente com o facto de desempenhar um papel crítico na resposta aos danos ao ADN . A complexidade da rede criada pelo telosome é praticamente baseada nas características estruturais únicas dos membros do shelterin., O TRF1 e o 2 possuem um domínio SAB/MYB pelo qual ambos reconhecem um motivo TTAGGTTA em telomere ds DNA, uma região terminal rica em ácidos (D / E) e um motivo de acoplamento específico chamado de motivo de homologia TRF (TRFH). O domínio TRFH mediata a homo-dimerização de TRF1 ou TRF2, mas proíbe a heterodimerização devido a restrições estruturais . Um motivo FxLxP e um motivo Y/FxLxP são necessários para a ligação TRF1 e TRF2, respectivamente. These domains are referred to as TRFH Binding Motifs (TBM). O resíduo de aminoácido Phe 142 no motivo TRF1-TRFH é responsável pela ligação do TIN2 através da sua região de TBM., O TIN2-TBM tem uma afinidade significativamente menor para a região correspondente de TRF2 (Phe 120) devido a diferenças estruturais na vizinhança de Phe 120 e, finalmente, está ligado ao TRF2 através de uma região TRF2 única perto do N-terminal da proteína. No entanto, o resíduo phe 120 é crucial para a interacção específica com outros factores associados ao telomere, como a nuclease Apollo, um parceiro de ligação TRF2. É provável que a formação complexa entre os membros do núcleo shelterin e fatores associados com motivos como TBM sejam também direcionados por mudanças nas afinidades de ligação devido a modificações pós-translacionais., Um bom exemplo é a parsilação TRF1 por tankyrase, resultando em diminuição significativa da afinidade DNA-TRF1, permitindo a separação telomere e telômeres irmãs, aliviando especificamente o complexo de coesão de TRF1 e TIN2 . O desequilíbrio de tais interações pode ser prejudicial para a integridade do genoma, como demonstrado por níveis elevados de TIFS formados em células sobre-expressando um TBM isolado como uma repetição de tandem YRL. Resultados deletérios análogos foram obtidos ao expressar um alelo de substituição TRF2-F120 .,
Recentes estudos estruturais de um dos dois OB (Oligonucleotide/oligossacarídeo-binding) dobras de S. pombe Pot1, que compõem o sítio de ligação de ssDNA, revelou que não-específica de nucleotídeos reconhecimento de ssDNA é conseguido até então não identificado modos de vinculação que termodinamicamente compensar base-as substituições meio alternativo de empilhamento de interações e novo H-ligação de redes . Assim, delinear em detalhe a estrutura dos membros do shelterin e fatores associados é esperado para melhorar geometricamente a nossa compreensão das redes consistiu e a forma como quantidade vs., as mudanças de qualidade interferem com as modificações estruturais que conduzem a alterações funcionais, ajustando finamente a estabilidade do genoma. Sem dúvida, a riqueza da informação recolhida já preparou o caminho para a utilização de agentes anti-telomerase em ensaios clínicos, com resultados esperados robustos.além do shelterin e parceiros interagindo, um outro complexo significativo surgiu recentemente para ser também envolvido na biologia telomere, o complexo CST. The CST complex is composed of CTC1, STN1 (OBFC1) and TEN1, and has been attributed the rescue of stalled replication forks during replication stress., O complexo CST interconecta telómeros à replicação e proteção do genoma, independentemente da via Pot1 .acumulando evidências de numerosas publicações inesperadamente demonstraram que a resposta a danos no DNA (DDR) e vias de reparo, apesar de parecer um paradoxo, compartilham características comuns com estratégias de manutenção telômero. As proteínas de resposta precoce da DDR são recrutadas para telómeros e as proteínas que se acredita funcionarem na manutenção do telomere também foram evidenciadas como estando envolvidas na DDR., Paradoxalmente, os fatores DDR em telómeros, em condições normais, parecem interferir com a restauração telômero e preservação do comprimento. Este fenômeno distinto é atribuído à coordenação shelterina dos fatores DDR acesso e função em telómeros. TRF2 pode se ligar e suprimir ATM, enquanto POT1, quando ligado à cauda-G através TPP1, inibe ATR. A supressão da actividade do TRF2 provoca a activação do p53 e do ATM, conduzindo à disfunção telomérica induzida pelo foci (TIFs). As TIFs resultam em fusões de telómeros de extremo a extremo através da via NHEJ e a sua aparência está correlacionada com a indução da senescência ., A interacção parece basear-se na quantidade de shelterina e no comprimento de telómeros, dois parâmetros directamente relacionados um com o outro, uma vez que quando os telómeros são criticamente curtos são menos susceptíveis de formar um ciclo-t, uma reacção catalisada pelo TRF2 in vitro e, por sua vez, menos shelterina está ligada . Consequentemente, duas das principais estruturas de manutenção do telomere são significativamente reduzidas (lacete t e revestimento de shelterin), permitindo a activação da DDR., Ainda assim, bastante curiosamente, NHEJ máquinas também pode exercer um papel protetor no telômeros através da atividade enzimática da Tankyrase relacionadas com a promoção do DNA-PKcs a estabilidade e a prevenção da formação de telômero irmã chromatid trocas (T-Sce) como um produto de inter-telômero recombinação
Outra intrigante paradigma é o complexo MRN (um complexo de proteínas de meióticas recombinação 11 (MRE11) – RAD50 e NBS1 proteínas), onde um único NBS1 molécula é associado a dois dímeros de MRE11 e RAD50 ., As proteínas MRE11 e RAD50 formam um heterotetramer que contém dois domínios de ligação e processamento de DNA que podem bridge extremidades livres de DNA . O complexo MRN localiza-se a telómeros durante as fases S e G2 do ciclo celular através da interacção directa do NBS1 com o TRF2, contribuindo presumivelmente para a formação da cauda-G na cadeia telomérica líder e, portanto, para a estabilidade telomérica ., Em humanos, a mutação no gene NBS1 leva ao transtorno de instabilidade cromossômica, síndrome de ruptura de Nijmegen 1, associado com maior sensibilidade à radiação ionizante e instabilidade cromossômica e desenvolvimento precoce de câncer, mesmo em NBS1+/- heterozigotos. NBS1 contains a forkhead-associated (FHA), a BRCT (BRCA1 C Terminus) domain, an MRE11-binding domain, and an ATM-interacting domain. A acumulação de provas demonstra que o NBS1 interage com telómeros e contribui para a sua estabilidade, pelo menos nas células humanas e nos ratos., Experimentos indiretos de imunofluorescência revelaram que NBS1 Co-localiza com TRF2 durante a fase S em células HeLa cultivadas, possivelmente modulando a formação de laço – T. Como o TRF2 também foi encontrado em sequências não-teloméricas, o impacto da co-localização NBS1 com o TRF2 requer maior clarificação. Do mesmo modo, nos fibroblastos embrionários do rato, foi observado o recrutamento activo de NBS1 para telómeros disfuncionais . O complexo MRN parece desempenhar um papel duplo na biologia telomérica. Um é mediar, pelo menos em parte, a resposta ATM levando à formação TIF após a eliminação TRF2 ., Em segundo lugar, pela sua atividade de nuclease, é necessário para o normal dos telómeros formação, como a MRN está implicado no processamento de danificado telômeros por influenciar a produção do balanço de um fim brusco dos telómeros criado após a telômero de replicação . Tal aceleração da formação da cauda-G, após a disfunção telomérica / desprotecção, impede a fusão das principais cadeias de telómeros desprotegidos durante a fase S. A nuclease Apollo também pode ser recrutada e estar envolvida neste processo., A interacção directa do NBS1 com o telomere repeat-binding factor 1 (TRF1) foi demonstrada para as células negativas imortalizadas da telomerase, o que implica que esta interacção pode estar envolvida no prolongamento alternativo dos telómeros. Além disso, na telomerase expressing cells, MRN complex, através da regulamentação e remoção de TRF1 (nbs1-fosforilação dependente de TRF1 por ATM) também pode promover a acessibilidade da telomerase para a 3 extremidade de telômeres ., A intercomunicação de reparação de DNA com a estabilidade telômero é uma relação estabelecida muito cedo na evolução, como indicado pelo fato de que MRE11 e RAD50, juntamente com proteínas cinases ATM e ATR, também são essenciais para a manutenção telômero adequada em plantas .
Figura 4.factores associados à Shelterina também envolvidos na resposta a lesões do ADN., Detalhes no texto
Recentemente, outra proteína fosfatase, PNUTS (fosfatase 1 nuclear-segmentação subunidade), que interage com o TRF2, insere outra peça no quebra-cabeça da DDR e o telômero relação . In addition, detected by genome-wide searching for TBM containing proteins, the three BRCT domain bearing MCPH1 proximal DDR factor also interacts with TRF2. As mutações MCPH1 estão associadas com defeitos de desenvolvimento e aumento da incidência do tumor ., As células empobrecidas MCPH1 apresentam níveis reduzidos de BRCA1 e Chk1 e são defeituosas no ponto de controlo G2/M.um papel essencial na integridade do telômero também é atribuído à BRCA2, um componente chave da via de reparação do DNA da HR. O BRCA2 associa-se a telómeros durante as fases do ciclo celular S/G2 e parece facilitar o carregamento de recombinases RAD51 . Por conseguinte, é necessária actividade de HR mediada pela BRCA2 para a manutenção do comprimento do telomere. Estes achados podem explicar, pelo menos em parte, os telómeros mais curtos encontrados em tumores mamários humanos mutados BRCA2., Portanto, a disfunção telomérica pode também estar implicada na instabilidade genómica observada em cancros da mama e do ovário com deficiência BRCA2 .
no total, um número de moléculas de reparação de DNA, que são coletivamente parte das vias HR, NHEJ, NER e Fanconi Anemia foram recrutadas em telómeros, com TRF2 funcionando principalmente como um hub de proteínas., Em condições normais, a sinalização ATM/ATR, após desprotecção devido à curta duração do telômero e subsequente “retirada” da célula (senescência / apoptose) faz parte do mecanismo de proteção normal de iniciação tumoral contra as células desestabilizadas pelo genoma. Nas células com comprimento de telômero normal existem relações inibitórias entre estes diferentes sistemas de reparo de DNA, impedindo a ativação um do outro.telómeros são parte da estrutura heterocromatina, o que significa que sinais específicos definem a sua localização no núcleo., Embora se espere que os telómeros sejam por definição estáveis e terminados inertes do cromossoma, no entanto, parecem ser complexos nucleoproteicos dinâmicos também envolvidos na remodelação da cromatina. Recruitment of heterochromatin binding protein HP1 , enriched tri-methylation of histone H3 lysine 9 (H3K9) and H4K20, as well as methylation of CpG dinucleotides in subtelomeric DNA repeats support this notion. Estas marcas heterocromáticas são substituídas por características de cromatina aberta (aumento da acetilação em caudas de histona, etc.) quando os telómeros ficam mais curtos., Tais mudanças implicam que um comprimento telômero mínimo é necessário para manter a conformação heterocromatina nas extremidades cromossômicas, uma estrutura que pode mudar após a atrito telômero. Além disso, os telómeros e o complexo de shelterina devem afrouxar a sua estrutura apertada durante a replicação cromossómica e restabelecer a sua forma compacta após a conclusão da duplicação de ADN. Em casos de restauração telomérica, deve ser necessário um análogo afrouxamento da estrutura telomérica através de mecanismos de reparação da telomerase ou do ADN, embora possivelmente através de procedimentos distintos., Para atingir esta plasticidade, a cromatina deve ser remodelada através de uma série de enzimas, de acordo com um código histone local . Uma série de modificações de histona estão implicadas onde interações distintas proteína-cauda de histona promovem relaxamento ou compressão da estrutura complexa de telômero . Como exemplo, SIRT6 (a histone H3K9 deacetilase que modula a cromatina telomérica) experimentos de depleção por interferência de RNA forneceram evidências de aumento de danos no DNA nuclear e a formação de focos induzidos pela disfunção telomérica., Estes experimentos sugeriram que a SIRT6 protege as células endoteliais a partir dos telómeros e genômica de danos ao DNA, impedindo, assim, uma diminuição na capacidade de replicação e o início da senescência prematura, neste caso específico, implicado na manutenção endoteliais homeostático funções e atraso vascular envelhecimento.
outro importante conjunto de factores que implicam na biologia telomérica são os produtos dos genes ATRX e DAXX, que estão implicados na remodelação da cromatina juntamente com a histona H3.3 ., As mutações ou supressões nestes loci genéticos têm sido directamente correlacionadas com o estado ALT+ em linhas celulares ou tumores per se . De acordo com estes resultados, o rastreio de mutações/expressão de ATRX/DAXX pode representar o marcador mais actualizado para os tumores que escolheram a via ALT TMM.,colectivamente, é a montagem adequada de abriginas em telómeros que é essencial para a estabilidade cromossómica (diferencia as extremidades dos cromossomas das quebras do ADN ds e evita a perda de informação genética através de um ataque nucleolítico (degradação mediada pela exonuclease) ou de fusão aberrante dos cromossomas e recombinação indesejável, durante o tempo de vida de uma célula., Juntamente com a estrutura adequada, a coordenação funcional que controla a actividade de TMM e telomerase é estritamente regulada ao longo do ciclo celular por uma série de factores acessórios implicados, transitoriamente recrutados pelos complexos de shelterina / subcomplexos .para além do seu papel protector, a interacção adequada das shelterinas com os componentes das máquinas de reparação do ADN, bem como com os Componentes da telomerase e o recrutamento da telomerase permite a restauração da telomerase, quando apropriado., A importância da estrutura – função correcta dos componentes de shelterina na biologia telomérica e na formação do cancro, juntamente com as doenças associadas a telomere, é representada pela Associação de detecção de mutações, ou seja, o TIN2, em muitos destes casos .