relacja struktura — funkcja telomeru
jak wspomniano powyżej, w przypadku braku telomerazy, telomery stają się niefunkcjonalne, skracają się wraz z kolejnymi podziałami komórkowymi, a termini chromosomów mogą się łączyć w wyniku de-ochrony. Fuzje telomerów są wynikiem niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), które jest jednym z dominujących mechanizmów gojenia podwójnego zerwania nici (DSB)., Rezultatem takich zdarzeń może być tworzenie chromosomów posiadających więcej niż jeden centromer, które prawdopodobnie zostaną połączone z przeciwległymi biegunami podczas mitozy, powodując pękanie chromosomów i dalszą niestabilność genomu poprzez powtarzające się zdarzenia fuzji – pęknięcia. U kręgowców rolę ochrony końca chromosomu w celu odróżnienia od przerw chromosomowych przypisuje się specyficznemu kompleksowi białek określanych łącznie jako shelterin. Kompleks Shelterin składa się zasadniczo z sześciu białek., Dwa człony kompleksu shelterin, TRF1 i TRF2 (od telomeru Repeat-binding Factor 1 i 2) wiążą się bezpośrednio z dwuniciową sekwencją telomeryczną, podczas gdy POT1 wiąże ssDNA. TRF2 wchodzi w interakcję z RAP1 i rekrutuje, podczas gdy TIN2 pośredniczy w wiązaniu TPP1 – POT1 z kompleksem rdzenia TIRF1 / TIRF2. POT1 wiąże się i chroni 3 jednoniciowy zwis DNA telomerów (ogon G), podczas gdy TIN2 prawdopodobnie łączy jednoniciowy i dwuniciowy kompleks wiążący DNA, szczególnie w obszarze telomerycznego tworzenia pętli D (ryc. 3)., Wydaje się, że ten rdzeniowy kompleks shelterin znajduje się głównie na końcu telomeru (określanym również jako telosom) i służy zarówno do stabilizacji struktury pętli t, chroniąc ją jednocześnie przed rozpoznaniem jako uszkodzenia DNA i naprawą przez NHEJ. Dodatkowo, shelterin reguluje dostęp do procesów przywracania TELOMERYCZNEGO DNA po każdej replikacji genomu., Ogólnie rzecz biorąc, kompleks shelterin wydaje się funkcjonować jako platforma regulująca rekrutację rosnącej listy czynników zaangażowanych w przebudowę chromatyny, replikację DNA, naprawę uszkodzeń DNA, rekombinację i funkcję telomerazy, regulując w ten sposób Dostęp / Modyfikację telomerów przez różne procesy komórkowe (ryc.
Rysunek 3.
schematyczny model potencjalnego układu telomerów przez kompleks shelterin., Białka kompleksu shelterin uczestniczą w ochronie telomerów, replikacji i regulacji długości. Białka TRF1 i TRF2 wiążą się specyficznie z TELOMERYCZNYM DNA ds, podczas gdy POT1 (TPP1) rozpoznaje ssDNA (stabilizująca pętla D). TIN2 łączy ssDNA z kompleksami wiążącymi dsDNA, stabilizując strukturę telosomu. TELOMERYCZNE DNA składa się z powtarzalnej sekwencji DNA, regionu dupleksu i zwisu g-nici ssDNA (G-nici, pomarańczowy; C-nici, niebieski). Kompleks shelterin wiąże się zarówno z regionami duplex, jak i ssDNA poprzez specyficzne interakcje białko-DNA., Tworzenie pętli t polega na inwazji pasma g-zwis, aby utworzyć pętlę przemieszczenia (pętla D). Pętla t jest proponowana do maskowania końca chromosomu z czujników uszkodzenia DNA. Ze względu na prostotę kompleks shelterin jest przedstawiony jako kompleks sześciobiałkowy jednorodnie rozproszony na telomerze. Więcej informacji można znaleźć w tekście.
Co ciekawe, wydaje się, że istnieje więcej niż jeden rodzaj rdzenia kompleksu shelterin i nie wszystkie z nich są koniecznie częścią telosomu. Wykryto kompleksy zawierające jedynie TRF1-TIN2-TPP1-POT1 lub TRF2-RAP1., Ostatnie dane mierzące bezwzględne i względne ilości TRF1 i TRF2 w komórce wykazały, że TRF2 jest około dwa razy bardziej obfite niż TRF1 i jest to zgodne z trf2 wykrywanym w przestrzennie ukierunkowanych ogniskach uszkodzeń DNA wywołanych w regionach chromosomów innych niż telomeryczne. Rekrutacja TRF2 do miejsc uszkodzeń DNA jest zgodna z tym, że odgrywa ona kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenia DNA . Złożoność tworzonej sieci telosomów jest praktycznie oparta na unikalnych cechach strukturalnych członków sieci., TRF1 i 2 posiadają domenę SAB / MYB, dzięki której obie rozpoznają motyw TTAGGGTTA na DNA telomeru DS, region terminalny bogaty w kwasy (D/E) oraz specyficzny motyw dokujący, zwany motywem homologii TRF (TRFH). Domena TRFH pośredniczy w homo-dimeryzacji TRF1 lub TRF2, ale zakazuje heterodimeryzacji z powodu ograniczeń strukturalnych . Motyw FxLxP i motyw Y/fxlxp są wymagane odpowiednio do wiązania TRF1 i TRF2. Domeny te są określane jako motywy wiązania TRFH (TBM). Pozostałość aminokwasu Phe 142 w motywie TRF1-TRFH odpowiada za Wiązanie CYNY2 przez jego region TBM., TIN2-TBM ma znacznie mniejsze powinowactwo do odpowiedniego regionu TRF2 (Phe 120) ze względu na różnice strukturalne w pobliżu Phe 120 i wreszcie jest przyłączony do TRF2 poprzez unikalny region TRF2 w pobliżu n-końca białka. Mimo to pozostałość Phe 120 ma kluczowe znaczenie dla specyficznej interakcji z innymi czynnikami związanymi z telomerami, takimi jak nukleaza Apollo, partner wiążący TRF2. Złożone formowanie się między elementami rdzenia i powiązanymi czynnikami z motywami podobnymi do TBM może być również kierowane przez zmiany w powiązaniach wiążących z powodu modyfikacji potranslacyjnych., Dobrym przykładem jest parsylacja TRF1 przez tankyrazę, co powoduje znaczne zmniejszenie powinowactwa DNA-TRF1, umożliwiając wydłużenie telomerów i rozdzielenie telomerów siostrzanych poprzez szczególne odciążenie kompleksu spójności z TRF1 i TIN2 . Nieprawidłowa równowaga takich interakcji może być szkodliwa dla integralności genomu, jak pokazano przez podwyższone poziomy TIFS utworzone w komórkach nadekspresujących izolowany TBM jako tandem YRL repeat. Analogiczne szkodliwe wyniki uzyskano przy ekspresji allelu substytucyjnego TRF2-F120 .,
ostatnie badania strukturalne jednego z dwóch fałdów OB (Oligonucleotide/oligosaccharide-binding) S. pombe Pot1, które obejmują miejsce wiązania ssDNA, ujawniły, że nieswoiste rozpoznawanie nukleotydów ssDNA jest osiągane przez dotąd niezidentyfikowane tryby wiązania, które termodynamicznie kompensują podstawienia poprzez alternatywne interakcje i nowe sieci wiązania H. W związku z tym należy szczegółowo określić strukturę członów i związanych z nimi czynników, aby geometrycznie poprawić nasze zrozumienie składanych sieci i sposób, w jaki ilość vs., zmiany jakościowe zakłócają modyfikacje strukturalne prowadzące do zmian funkcjonalnych, precyzyjnie dostrajając stabilność genomu. Niewątpliwie bogactwo zgromadzonych informacji utorowało już drogę do stosowania leków przeciwtelomerazowych w badaniach klinicznych, z solidnym oczekiwanym rezultatem.
oprócz shelterin i partnerów, niedawno pojawił się inny znaczący kompleks, który również zajmuje się biologią telomerów, kompleks CST. Kompleks CST składa się z CTC1, STN1 (OBFC1) i TEN1 i przypisuje się ratowanie zablokowanych widełek replikacyjnych podczas naprężeń replikacyjnych., Kompleks CST łączy telomery z replikacją genomu i ochroną niezależnie od szlaku Pot1 .
nagromadzenie dowodów w licznych publikacjach dość niespodziewanie wykazało, że DNA damage response (DDR) i ścieżki naprawy, pomimo pozornego paradoksu, mają wspólne cechy ze strategiami utrzymania telomerów. DDR białka wczesnej odpowiedzi są rekrutowane do telomerów i białka, które uważa się za działające w utrzymaniu telomerów, również udowodniono, że biorą udział w DDR., Paradoksalnie, czynniki DDR w telomerach, w normalnych warunkach, wydają się zakłócać telomerów przywrócenie i zachowanie długości. To odrębne zjawisko przypisuje się koordynacji dostępu i funkcji czynników DDR w telomerach. TRF2 może wiązać się i tłumić ATM, podczas gdy POT1, gdy jest związany z ogonem G przez TPP1, hamuje ATR. Zahamowanie aktywności TRF2 wywołuje aktywację p53 i ATM, co prowadzi do wywołania ognisk wywołanych dysfunkcją telomerów (TIFs). TIFs skutkować end-to-end telomer fusions przez szlak nhej i ich pojawienie jest skorelowany z indukcją starzenia ., Interakcja wydaje się być oparta na ilości shelterin i długości telomerów, dwóch parametrach bezpośrednio związanych ze sobą, ponieważ gdy telomery są krytycznie krótkie, są mniej prawdopodobne, aby utworzyć pętlę t, reakcję katalizowaną przez TRF2 in vitro, a z kolei mniej shelterin jest związany . W związku z tym dwie główne struktury telomerów są znacznie zredukowane (Pętla t i powłoka ochronna), umożliwiając aktywację DDR., Mimo to, dość intrygujące, maszyny NHEJ mogą również odgrywać rolę ochronną w telomerach poprzez aktywność enzymatyczną Tankyrazy związaną z promocją stabilności DNA-PKcs i zapobieganiem tworzeniu się chromatyd siostrzanych telomerów (T-SCE) jako produktu rekombinacji między telomerami
innym intrygującym paradygmatem jest kompleks MRN (kompleks białkowy rekombinacji mejotycznej 11 (MRE11)-rad50 i białek NBS1), w którym pojedynczy nbs1 cząsteczka jest związana z dwoma dimerami MRE11 i rad50 ., Białka MRE11 i RAD50 tworzą heterotetramer, który zawiera dwie domeny wiążące i przetwarzające DNA, które mogą mostkować wolne końce DNA . Kompleks MRN lokalizuje się w telomerach podczas fazy S I G2 cyklu komórkowego poprzez bezpośrednie oddziaływanie NBS1 z TRF2, prawdopodobnie przyczyniając się do formowania się ogona G na wiodącej nici telomerycznej, a tym samym do stabilności telomerów ., U ludzi mutacja w genie NBS1 prowadzi do zaburzenia niestabilności chromosomalnej, Nijmegen breakage syndrome 1, związanego ze zwiększoną wrażliwością na promieniowanie jonizujące i niestabilność chromosomalną i wcześnie rozwijającego się raka nawet w heterozygotach nbs1+/ -. Nbs1 zawiera domenę związaną z widłami (FHA), domenę Terminus BRCT (BRCA1 C), domenę wiążącą MRE11 i domenę oddziałującą z ATM. Zgromadzone dowody wskazują, że nbs1 oddziałuje z telomerami i przyczynia się do ich stabilności, przynajmniej w komórkach ludzkich i mysich., Pośrednie immuno-fluorescencyjne eksperymenty ujawniły, że nbs1 współlokalizuje z TRF2 podczas fazy s W hodowanych komórkach HeLa, prawdopodobnie modulując tworzenie pętli T. Ponieważ TRF2 został również znaleziony na sekwencjach nie-telomerycznych, wpływ Ko-lokalizacji NBS1 z TRF2 wymaga dalszych wyjaśnień. Podobnie w fibroblastach zarodkowych myszy zaobserwowano aktywną rekrutację NBS1 do dysfunkcyjnych telomerów . Kompleks MRN wydaje się odgrywać podwójną rolę w biologii telomerów. Jednym z nich jest pośredniczenie, przynajmniej częściowo, w reakcji ATM prowadzącej do tworzenia się TIF po delecji TRF2 ., Po drugie, ze względu na aktywność nukleazy, jest on wymagany do normalnego tworzenia telomerów, ponieważ MRN jest zaangażowany w przetwarzanie uszkodzonych telomerów poprzez wpływ na produkcję zwisu z tępego telomeru końcowego utworzonego po replikacji telomerów . Takie przyspieszenie tworzenia się ogona G, po dysfunkcji telomerów / de-protection zapobiega fuzji wiodących tępo zakończonych nici de-protection telomerów podczas fazy S. Nukleazy Apollo mogą być również rekrutowane i być zaangażowane w ten proces., Wykazano bezpośrednią interakcję NBS1 z telomerem repeat-binding factor 1 (TRF1) dla nieśmiertelnych komórek telomerazy ujemnej, co sugeruje, że interakcja ta może być zaangażowana w alternatywne wydłużanie telomerów. Ponadto w komórkach ekspresji telomerazy, kompleks MRN, poprzez downregulację i usunięcie TRF1 (fosforylacja trf1 zależna od NBS1 przez ATM) może również promować dostępność telomerazy do 3 końca telomerów ., Interkomunikacja naprawy DNA ze stabilnością telomerów jest relacją ustaloną dość wcześnie w ewolucji, na co wskazuje fakt, że mre11 i RAD50 wraz z kinazami białkowymi ATM i ATR są również niezbędne do prawidłowego utrzymania telomerów w roślinach .
Rysunek 4.
, Szczegóły w tekście
Ostatnio Inna fosfataza białkowa, pnuts (podjednostka ukierunkowana na fosfatazę 1), która wchodzi w interakcję z TRF2, wstawia kolejny element układanki relacji DDR i telomere . Ponadto, wykryty przez genomowe poszukiwania białek zawierających TBM, trzy domeny BRCT zawierające mcph1 proksymalny czynnik DDR również oddziałują z TRF2. Mutacje MCPH1 są związane z wadami rozwojowymi i zwiększoną częstością występowania nowotworów ., Komórki zubożone MCPH1 wykazują obniżony poziom BRCA1 i Chk1 i są wadliwe w punkcie kontrolnym G2/M.
istotną rolę w integralności telomerów przypisuje się również BRCA2, kluczowemu składnikowi szlaku naprawy DNA HR. BRCA2 wiąże się z telomerami podczas faz cyklu komórkowego s / G2 i wydaje się ułatwiać Ładowanie rekombinazy RAD51 . W związku z tym do utrzymania długości telomerów wymagana jest aktywność HR z udziałem BRCA2. Te odkrycia mogą wyjaśniać, przynajmniej częściowo, krótsze telomery Znalezione w BRCA2 zmutowanych ludzkich guzów piersi., Dlatego też dysfunkcja telomerów może być również związana z niestabilnością genomową obserwowaną w rakach piersi i jajników z niedoborem BRCA2 .
w sumie stwierdzono, że w telomerach rekrutuje się wiele cząsteczek naprawczych DNA, które są łącznie częścią szlaków HR, NHEJ, NER i Fanconiego, a TRF2 działa głównie jako węzeł białkowy., W normalnych warunkach sygnalizacja ATM/ATR, po odizolowaniu z powodu krótkiej długości telomeru i późniejszej „emerytury” komórki (starzenie / apoptoza) jest częścią normalnego mechanizmu ochronnego inicjacji nowotworu przeciwko destabilizowanym komórkom genomu. W komórkach o prawidłowej długości telomerów istnieją relacje hamujące między tymi różnymi systemami naprawy DNA, zapobiegające wzajemnej aktywacji.
telomery są częścią struktury heterochromatyny, co oznacza, że określone sygnały określają ich lokalizację w jądrze., Chociaż oczekuje się, że telomery są z definicji stabilne i obojętne końce chromosomów, niemniej jednak wydają się być dynamicznymi kompleksami nukleoproteinowymi również zaangażowanymi w przebudowę chromatyny. Rekrutacja białka wiążącego heterochromatynę HP1, wzbogacona tri-metylacja histonu H3 lizyny 9 (H3K9) i H4K20 , a także metylacja dinukleotydów CpG w subtelomerycznych powtórzeniach DNA wspierają to pojęcie. Te znaki heterochromatyczne są zastępowane przez cechy otwartej chromatyny (zwiększona acetylacja na ogonach histonów itp.), gdy telomery stają się krótsze., Takie zmiany sugerują, że minimalna długość telomerów jest wymagana do utrzymania konformacji heterochromatyny na końcach chromosomów, struktury, która może ulec zmianie po wyniszczeniu telomerów. Ponadto telomery i Kompleks shelterin powinny rozluźnić swoją zwartą strukturę podczas replikacji chromosomów i przywrócić ich zwartą formę po zakończeniu duplikacji DNA. Analogiczne rozluźnienie struktury telomeru powinno być wymagane w przypadkach przywrócenia telomeru za pomocą telomerazy lub mechanizmów naprawy DNA, chociaż prawdopodobnie za pomocą odrębnych procedur., W celu uzyskania tej plastyczności chromatyna powinna być przebudowywana przez szereg enzymów, zgodnie z lokalnym kodem histonu . Istnieje wiele modyfikacji histonów, w których różne interakcje ogona histonu z białkami sprzyjają relaksacji lub kompresji struktury telomeru . Jako przykład, sirt6 (deacetylaza histonowa h3k9, która moduluje chromatynę telomeryczną) eksperymenty zubożenia przez interferencję RNA dostarczyły dowodów na zwiększone uszkodzenia jądrowego DNA i tworzenie ognisk wywołanych dysfunkcją telomerów., Eksperymenty te sugerowały, że SIRT6 chroni komórki śródbłonka przed uszkodzeniem telomerów i genomowego DNA, zapobiegając w ten sposób zmniejszaniu zdolności replikacyjnych i przedwczesnemu starzeniu się, w tym konkretnym przypadku związanym z utrzymaniem homeostatycznych funkcji śródbłonka i opóźnieniem starzenia się naczyń.
innym ważnym zestawem czynników implikujących w biologii telomerów są produkty genów ATRX i DAXX, które są zaangażowane w przebudowę chromatyny wraz z histonem H3.3 ., Mutacje lub delecje w tych genetycznych loci były bezpośrednio skorelowane ze statusem ALT+ na liniach komórkowych lub guzach per se . Zgodnie z tymi wynikami badania przesiewowe w kierunku mutacji/ekspresji ATRX/DAXX mogą stanowić najbardziej aktualny marker dla guzów, które wybrały szlak ALT TMM.,
Ogólnie rzecz biorąc, jest to prawidłowy montaż osłon w telomerach, który jest niezbędny dla stabilności chromosomu (różnicuje końce chromosomów od przerw DNA ds i zapobiega utracie informacji genetycznej poprzez atak nukleolityczny (degradacja za pośrednictwem egzonukleazy) lub aberrant fuzji chromosomów i niepożądanej rekombinacji, podczas życia komórki., Wraz z odpowiednią strukturą, koordynacja funkcjonalna kontrolująca aktywność TMM i telomerazy jest ściśle regulowana w całym cyklu komórkowym przez szereg powiązanych czynników dodatkowych, przejściowo rekrutowanych przez kompleksy / subkompleksy shelterin .
oprócz roli ochronnej, właściwa interakcja osłonic z komponentami maszyn do naprawy DNA, a także składnikami telomerazy i rekrutacją telomerazy, umożliwia w razie potrzeby odbudowę telomerów., Znaczenie prawidłowej struktury-funkcji składników osłonki w biologii telomerów i powstawaniu nowotworów, wraz z chorobami związanymi z telomerami, przedstawia związek wykrywania mutacji w TIN2 w wielu z tych przypadków .