obserwacja
wiele postępu w mikrobiologii zależy od badania „czystych kultur.”Są to kultury, które zawierają tylko jeden typ komórki, najlepiej z kulturą pochodzącą z początkowej pojedynczej komórki., Od wczesnego rozwoju metod ustanawiania czystych kultur (1), było wiele przykładów, w których kultury, które początkowo uważane były za czyste, następnie stwierdzono, że zawierają dwa rodzaje drobnoustrojów. W niektórych przypadkach te niezamierzone Kultury wielogatunkowe doprowadziły do ważnych przełomów, takich jak odkrycie międzygatunkowego transferu wodoru (2). Jednak wraz z pojawieniem się technologii głębokiego sekwencjonowania można rozsądnie przewidzieć, że niewykryte zanieczyszczenia w kulturach nie będą już znaczącym problemem.,
szczep Geobacter sulfurreducens PCA wyizolowano w połowie lat 90.za pomocą standardowych technik wzbogacania i izolacji, które obejmowały rozcieńczenie do wyginięcia w ciekłym środowisku, a następnie powtarzające się smugi izolowanych kolonii na podłożu zestalonym agarem (3). Jest to klasyczna strategia nauczana w najpopularniejszych podręcznikach mikrobiologii wprowadzającej (4-6). Później G. sulfurreducens szczep DL1 został uzyskany przez dodatkowe wznowienie izolowanych Kolonii PCA (7). Wraz z rozwojem metod manipulacji genetycznej G. sulfurreducens (7) i sekwencjonowania jego genomu (8), G., sulfurreducens stały się gatunkami Geobakterii z wyboru do badania fizjologii i nowych pozakomórkowych właściwości przenoszenia elektronów tego ważnego dla środowiska rodzaju (9). Początkowe sekwencjonowanie genu 16S rRNA w kulturze (3), a także sekwencjonowanie genomu najpierw do 8-krotnego (8), a następnie do 80-krotnego (10, 11) pokrycia, wskazywało, że kultura zawierała tylko jeden szczep.,
próbując adaptacyjnie ewoluować DL1 w celu wytworzenia większej ilości prądu, zaszczepiono go do układu bioelektrycznego z anodą grafitową o potencjale (-400 mV w porównaniu z Ag / AgCl) uważanym za Bliski dolnej granicy, przy której możliwa byłaby obecna generacja z octanu (12). Izolat otrzymany z biofilmu anodowego, oznaczony jako G., sulfurreducens szczep KN400 (12), jest lepszy od szczepu inokulum w wytwarzaniu prądu elektrycznego, a ta wyższość jest przypisywana przynajmniej częściowo jego zdolności do wytwarzania więcej „nanowirów drobnoustrojów”, elektrycznie przewodzących włókien białkowych, które wykazują metaliczną przewodność elektryczną (13, 14).
początkowo zakładano, że szczep KN400 zgromadził jedną lub więcej mutacji, które zwiększały jego zdolność do zewnątrzkomórkowego przenoszenia elektronów., Byłoby to analogiczne do selekcji zmutowanych szczepów podczas adaptacyjnej ewolucji szczepu DL1 do wymiany elektronowej z innymi organizmami (11) lub wyższych szybkości redukcji tlenku Fe(III) (10). Jednak genomika porównawcza wykazała, że sekwencja genomu szczepu KN400 zawiera ponad 27 270 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) (15). Jedna trzecia genów miała co najmniej jeden polimorfizm nukleotydowy, a jedna czwarta miała polimorfizm, który wpływał na powstałą sekwencję białek (15). Na podstawie typowych mutacji 6.,3 × 10-9 / bp na pokolenie (16), potrzeba ponad 1000 lat, aby zgromadzić tak wiele mutacji w szczepie DL1. Ponadto nie ma ortologów w szczepie DL1 dla 139 otwartych ramek odczytu (ORFs) w genomie szczepu KN400, z których większość jest najbliżej spokrewniona z genami w organizmach zróżnicowanych filogenetycznie (15).
te względy i fakt, że ORF unikalne dla KN400 nie zostały wykryte podczas resekwencjonowania hodowli inokulum (10, 11) doprowadziły do hipotezy, że KN400 wszedł do układu bioelektrochemicznego jako zanieczyszczenie., Aby ocenić tę możliwość, czystość Kultury DL1 została dodatkowo oceniona z jeszcze większą czułością.
zarówno DL1, jak i KN400 zawierają omcS, gen dla zewnętrznego cytochromu powierzchniowego, który ma jeden z najwyższych proporcji SNPs (36 SNPs / kb) pomiędzy tymi dwoma szczepami (15). Gen ten został wzmocniony z hodowli DL1, która została użyta do zaszczepienia układu bioelektrochemicznego, a produkty PCR zostały zsekwencjonowane za pomocą Illumina Hi-Seq 2000 (patrz tekst S1 w materiale uzupełniającym)., Wykryto sekwencję KN400, co wskazuje, że KN400 był obecny w początkowym inokulum używanym do badania doboru anod. Jednak z >107 sekwencji wysokiej jakości odzyskanych, tylko 286 było sekwencjami KN400 w porównaniu z sekwencjami 1,5 × 107 DL1 (Tabela 1).
tekst S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
jest to artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, który pozwala na nieograniczone niekomercyjne wykorzystanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem, że oryginalny autor i źródło są zapisane.,
- wyświetl inline
- wyświetl popup
szacunki liczebności szczepu KN400 w różnych kulturach
tabela S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
jest to artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na warunkach Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Licencja Nieoportowana, która pozwala na nieograniczone niekomercyjne wykorzystanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem uznania oryginalnego autora i źródła.
względna obfitość szczepu KN400 w tej samej hodowli była następnie oceniana za pomocą ilościowego PCR (qPCR) z zestawem podkładowym specyficznym dla genu występującego tylko w KN400 (patrz tekst S1 i tabela S1 w materiale uzupełniającym) oraz zestawem podkładowym, który wykrywał zarówno KN400, jak i DL1 (patrz tabela S1 w materiale uzupełniającym)., Względna obfitość sekwencji specyficznej dla KN400 była podobna do sekwencji KN400 omcS określonej metodą sekwencjonowania (Tabela 1). Analiza sekwencji i test qPCR Kultury PCA zdeponowanej w ATCC ujawniły obecność KN400 przy podobnej niskiej obfitości (Tabela 1).
próbowaliśmy usunąć rzadkie zanieczyszczenia KN400 z kultury DL1 poprzez powtarzające się wznawianie izolowanych Kolonii wyhodowanych na zestalonym podłożu octanowo-fumaranowym (7), ale szczep KN400 nadal utrzymywał się z niską częstotliwością w izolowanych koloniach (Tabela 1)., Jednakże hodowlę, w której KN400 nie można było już wykryć, uzyskano w płynnym podłożu octanowo-fumaranowym (zob. tekst S1 w materiale uzupełniającym), w którym największe rozcieńczenie wykazujące wzrost poddano kilku kolejnym rundom seryjnego rozcieńczenia (Tabela 1). Wykazano, że szczep DL1 nie wymaga rzadkiej obecności KN400, aby rosnąć w podłożu octanowo-fumaranowym, na którym ta kultura jest rutynowo utrzymywana.
Kiedy czysta KN400 i wolna od KN400 hodowla DL1 zostały zaszczepione do octanu fumaranu medium w równych ilościach, DL1 wykluczone KN400 (rys., 1a). Jest to zgodne ze stwierdzeniem, że gdy oba szczepy były hodowane oddzielnie, DL1 rosło znacznie szybciej niż KN400 (gęstość optyczna przy 600 nm wynosząca 0,04 dla KN400 w porównaniu z 0,65 dla DL1 po 36 godzinach inkubacji; patrz Rys. S2 w materiale uzupełniającym) w tym samym medium. Odsetek KN400 nadal malał wraz z kolejnymi transferami (1% inokulum), dopóki obfitość KN400 nie była porównywalna do tej w hodowlach stad PCA i DL1 (patrz tekst S1 w materiale uzupełniającym). KN400 1a).,
rysunek S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
jest to artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, który pozwala na nieograniczone niekomercyjne wykorzystanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem, że oryginalny autor i źródło są zapisane.,
wzrost i aktywność szczepu KN400 w różnych warunkach wzrostu. a) względna obfitość KN400 w kolejnych transferach Mid-log (1% inokulum) Kultury zainicjowanej w równych proporcjach KN400 i DL1. Wyniki to średnie i odchylenia standardowe kultur trójplikowych. B) produkcji bieżącej, gdy kultura DL1 została wprowadzona do komory anodowej układu bioelektrochemicznego z anodą grafitową przy -400 mV w porównaniu z Ag / AgCl. Kultura wolna od KN400 w tym czasie nie wytwarzała prądu., C) Względna obfitość KN400 w biofilmach anodowych, gdy początkowym inokulum była kultura DL1, która następnie okazała się również zawierać KN400. Wyniki to średnie i odchylenia standardowe kultur trójplikowych.
powtarzane próby wyhodowania wolnej od KN400 Kultury DL1 na anodzie ustawionej przy -400 mV nie powiodły się. Jednak prąd był łatwo wytwarzany w innym zestawie eksperymentów, w których kultura DL1 zawierająca KN400 służyła jako inokulum (rys. 1b)., Badanie qPCR DNA wyekstrahowanego z biofilmu anodowego wykazało, że 100% sekwencji omcS było KN400 w ramach drugiego transferu (rys. 1c). Wyniki te sugerowały, że powodem pojawienia się KN400 na anodach było to, że szczep DL1 nie był w stanie rosnąć w narzuconych warunkach. Bez tej niezwykłej presji selektywnej, KN400 pozostałby niewykryty w kulturach PCA i DL1 nawet przez obecnie dostępne metody sekwencjonowania nowej generacji, które teoretycznie mogą zapewnić tysiąc razy większy zasięg w sekwencjonowaniu genomu.,
czynniki przyczyniające się do długotrwałego utrzymywania się szczepu KN400 przy bardzo niskiej częstotliwości w kulturze DL1 pozostają tajemnicą. Znaczenie fizycznego izolowania pojedynczych komórek metodami bardziej definitywnymi niż smugowanie na stałym podłożu w celu ustanowienia czystych kultur zostało uznane od pewnego czasu (17), a coraz bardziej wyrafinowane metody osiągnięcia tego są nadal rozwijane (18-23)., Jednak metody poszycia, które są stosowane od ponad 100 lat i są nauczane przez każdego studenta mikrobiologii jako standardowe procedury uzyskiwania czystych kultur (4-6), pozostają najczęstsze. Wyniki przedstawione tutaj pokazują, że bez izolacji jednokomórkowej, tajemnicze zanieczyszczenia mogą przetrwać z bardzo niską częstotliwością w kulturach przez dziesięciolecia intensywnych badań i mogą uniknąć wykrycia nawet najbardziej wyrafinowanych metod sekwencjonowania obecnie dostępnych.,
rysunek S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
jest to artykuł o otwartym dostępie rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, który pozwala na nieograniczone niekomercyjne wykorzystanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem, że oryginalny autor i źródło są zapisane.,