3.1.2.2. HPLC
HPLC przy użyciu ruchomych faz na bazie acetonitrylu lub heksanu umożliwia bezpośrednią detekcję fosfolipidów bez uprzedniego oczyszczenia surowego ekstraktu, dzięki czemu metody te są proste i szybkie. Jednak metody te nie skutecznie oddzielają różnych fosfolipidów inozytolu. Nakamura i in. (1989) opracowali procedurę HPLC, która konkretnie analizuje PTDIN i PtdInsP2 w mózgu., W tej metodzie ekstrakt lipidowy jest najpierw derywatyzowany z 9-antryldiazometanem w celu wytworzenia(9-antrylowego) PtdInsP i di (9-antrylowego) PtdInsP2, a następnie derywatyzowana próbka jest oddzielana przez HPLC z detekcją UV przy 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn i SM nie są derywatyzowane za pomocą tego odczynnika i dlatego nie zakłócają testu (Yamada et al., 1988). Metoda ta jest bardziej wrażliwa niż metoda detekcji ultrafioletowej w przypadku analizy fosfolipidów inozytolu.
Low (1990) opisał zastosowanie kolumn celulozowych DEAE do preparatywnego HPLC lipidów mózgowych., Fosfolipidy mózgu rozpuszczone w 50 ml rozpuszczalnika a (chloroform / metanol / H2O, 20: 9: 1, wg vol.) i naniesiony na kolumnę celulozową (DEAE cellulose, Sigma), którą przemywa się alkaliami i kwasem do neutralności. Myta celuloza DEAE pakowana jest w szklaną kolumnę (2 cm × 38 cm) z odpornymi na rozpuszczalniki okuciami. Kolumna jest następnie eluowana przy natężeniu przepływu 100 ml / h z 11 liniowym gradientem od 100% rozpuszczalnika A do 100% rozpuszczalnika B (rozpuszczalnik a zawierający 0,6 M octanu amonu), a frakcje 13-15 ml są zbierane i badane na obecność fosforu (rys. 3.3).,
rys. 3.3. Izolacja PtdInsPs z mózgu bydlęcego metodą chromatografii kolumnowej DEAE-celulozy. Przemyta kwasem frakcja Folch wytrącona metanolem została wymyta z kolumny celulozowej DEAE z gradientem 100% rozpuszczalnika A (chloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, według obj.) do 100% rozpuszczalnika B (rozpuszczalnik a zawierający 0,6 M octanu amonu) i 13-15 ml zebranych frakcji. Frakcje zostały zbadane na obecność fosforu organicznego. Średni odzysk zastosowanego fosforu organicznego wynosił około 90%., Szczyt eluting w liczbie ułamkowej. 25 było powtarzalnie obecne, ale nie zostało zidentyfikowane. Skład pików określono na podstawie analizy TLC frakcji zbiorczych. Piki są identyfikowane, jak pokazano na rysunku.
reprodukowane z Low (1990) za zgodą wydawcy.
alternatywnie, Low (1990) przeprowadził etap chromatograficzny za pomocą preparatywnego HPLC przy użyciu kolumny aminowej. Fosfolipidy mózgu rozpuszczono w 5 ml rozpuszczalnika A i nanoszono przy przepływie 2.,5 ml/min do kolumny amino-NP o wymiarach 10 mm × 250 mm (krzemionka sferyczna 5 µm z fazą wiązaną N-propyloaminą, IBM Instruments, Danbury, CT) z kolumną ochronną o wymiarach 4,5 mm × 50 mm równomiernie z rozpuszczalnikiem A. kolumna jest eluowana przy natężeniu przepływu 2,5 ml/min z 25 ml rozpuszczalnika A, gradientem 125 ml 100% rozpuszczalnika A do 100% rozpuszczalnika B i 100 ml 100% rozpuszczalnika B; gromadzone są frakcje 5 ml. Zbiorcze frakcje są zagęszczane przez dostosowanie do 18 ml rozpuszczalnika A i ekstrahowane fosfolipidy. Średni odzysk fosforu organicznego wynosi 80%., Uzyskano całkowitą separację PTDIN (90 ml), PtdInsP (150 ml) i PtdInsP2 (160-200 ml) (nie przedstawiono chromatogramu). Jednak PtdIns pokrywają się z PtdSer. Skład pików określano za pomocą TLC ułamków zespolonych.
Low (1990) opisał również oczyszczanie HPLC oznaczonych PtdIns(4)P i PtdIns(4,5)P2 z ludzkich płytek krwi. Ekstrakt lipidowy z płytek krwi został przygotowany z 60 ml świeżej krwi ludzkiej w obecności metanolu wytrąconego z mózgu bydlęcego PtdInsPs jako nośnika, ostatecznie zostaje ponownie rozpuszczony w 0.,5 1 rozpuszczalnika a i naniesiony przy natężeniu przepływu 1 ml/min na kolumnę amino-NP 4,5 mm × 250 mm równoważoną w rozpuszczalniku A. kolumnę eluuje się 5 ml rozpuszczalnika A (25 ml gradientu liniowego od 100% rozpuszczalnika A do 100% rozpuszczalnika B) i 20 ml rozpuszczalnika B. zbiera się jedną mililitrową frakcję i określa radioaktywność za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego. Średni odzysk zastosowanej radioaktywności wynosi około 70%. Istnieje doskonała rozdzielczość trzech fosfatydów inozytolu, ale Ptdyny pokrywają się z PtdOH., Dlatego ta procedura HPLC nie jest odpowiednia do przygotowania Ptdyn, ponieważ PtdOH, który w większości typów komórek jest szybciej oznaczany przez Pi, NIE JEST z niego rozwiązany. Jest prawdopodobne, że inne anionowe fosfolipidy, takie jak PtdSer, będą słabo rozwiązywane z PtdIns przez kolumnę amino-NP, jak zaobserwowano w procedurze DEAE-celuloza.
jak wspomniano powyżej, żadna z powyższych metod nie jest skuteczna w oddzielaniu poszczególnych PtdInsPs w czystej postaci od surowych ekstraktów tkankowych. Dlatego ekstrakty lipidowe muszą być przetwarzane przez kilka etapów chromatograficznych., W tym celu ekstrakt poddaje się najpierw chromatografii Sephadex w celu oddzielenia lipidów od nielipidów w ekstrakcie. Frakcja lipidowa jest następnie wlewana na kolumnę DEAE, która jest eluowana za pomocą różnych rozpuszczalników. Ptdinsp są odzyskiwane przez elucję z chloroformem / metanolem / solą amonową jako końcowym etapem elucji. Poszczególne frakcje są zagęszczane do 100 µl w temperaturze 45°c pod wpływem azotu, a następnie zagęszczona pozostałość jest dalej oddzielana za pomocą chromatografii kasetowej, TLC, HPLC lub innych procedur chromatograficznych.,
Singh (1992) opisał ekstrakcję i analizę PtdIns, PtdIns(4)P i PtdIns(4,5)P2 przy użyciu wkładu Sep-Pak. Całkowity ekstrakt lipidowy (Folch et al., 1957) z synaptosomów mózgu szczura i mikroelementów po raz pierwszy przygotowano i zebrano pierwszą frakcję wygenerowaną (frakcja 1), a następnie ekstrahowano w celu oddzielenia fosfolipidów i glikolipidów, jak opisano przez Dugan et al. (1986). Frakcję fosfolipidową poddano chromatografii DEAE-celulozowej (Sekwencja separacji 4) zgodnie z opisem Rousera i wsp. (1969) do dalszego oczyszczania lipidów inozytolu., Oczyszczony ekstrakt został przeniesiony do wkładu Sep-Pak. Różne lipidy inozytolu są eluowane z kolumny z liniowym gradientem octanu amonu i wody z 0,5% octanu amonu (200 mM) i 99,5% wody do 75% octanu amonu i 25% wody w ciągu 60 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min (patrz rozdział 2). Eluat kolumnowy przez 120 min zebrano w frakcjach 1-ml. Różne piki zidentyfikowano za pomocą pików PTDIN, PTDIN(4)P i PTDIN(4,5)P2 jako punktów odniesienia., Frakcje zawierające poszczególne lipidy inozytolu zostały połączone i przeanalizowane przez HPLC zgodnie z opisem Geurts van Kessel et al. (1977). Pojedyncze fosfolipidy zostały wykryte przy 206 nm za pomocą detektora diodowego zaprogramowanego do skanowania zakresu 200-350 nm. Singh (1992) wykazał 50-90% odzysku PTDIN i InsPs z próbek mózgu. InsP3 i InsP4 wykazały najniższy odzysk ze względu na słabą kwantyfikację, a nie słabą metodę ekstrakcji. Metody nabojowe nie zostały zastosowane do izolacji Ptdyn(3)P, Ptdyn (3,4) P2 i Ptdyn (3,4,5) P3.
, (1992) opisał izolację PtdInsPs od trzustki szczurów. Każda trzustka została natychmiast homogenizowana w 3 ml chloroformu / metanolu (1: 2, v / v), a około 3 MBq Ptdyn znakowanych 3H(4)P lub Ptdyn(4,5) P2 dodano razem z 0,6 ml 1,2 aq. HCl przed ekstrakcją chloroformem, jak opisał Schacht (1981). Metanol dodano do zbiorczych i przemytych ekstraktów w celu uzyskania chloroformu / metanolu (3: 2, v / v). Roztwór nanoszono na kolumnę Lipidex-DEAE, a większość lipidów eluowano chloroformem / metanolem (3: 2, v/v) lub chloroformem / metanolem / wodą(3: 6: 1 według obj.)., PtdIns i PtdSer zostały wymyte razem z 0,03 M H3PO4 i niezidentyfikowanego materiału z 0,1 M H3PO4. PtdIns (4)P wymazano z 0,25 M H3PO4, a PtdIns(4,5)P2 z 0,5 M H3PO4, jak wskazuje elutowana radioaktywność. Wszystkie frakcje ekstrahowano 0,4 ml wody/ml eluatu. Górna faza została cofnięta o 0,1 V. chloroformu. Zbiorcze fazy chloroformu płukano 0,4 V. 0,5 m HCl w 50% aq. metanol. Frakcje zostały użyte do oznaczania gatunków molekularnych za pomocą Fab/MS (patrz niżej).
, (1997) wykorzystano normalną fazę HPLC z detekcją rozpraszania światła parowego do analizy komercyjnych próbek PtdInsPs wraz z innymi fosfolipidami. Zastosowanie liniowego gradientu a, chloroform / metanol / amoniak (50:45: 3, według vol.) i B, chloroform / metanol / woda / amoniak (25:55:17: 3, by vol.) uzyskuje się dobrze rozwiązane późne pojawiające się piki dla PTDIN (4)P i PTDIN (4,5) P2. Krzywe odpowiedzi dawki dla PtdIns (4)P i PtdIns (4,5) P2 nie były liniowe ,co jest charakterystyczne dla detektora rozpraszania światła (wyniki nie zostały pokazane)., Dla większości celów technika HPLC jest lepsza pod względem rozdzielczości, szybkości i ogólnej wygody w stosunku do procedury DEAE-celuloza i jest metodą z wyboru, jeśli sprzęt HPLC jest dostępny. DEAE-celuloza jest tania i oczyszczanie na dużą skalę może wymagać użycia tego materiału. Procedura HPLC jest również lepsza od niektórych lub pod każdym względem od alternatywnych procedur oczyszczania polifosfoinozytydów, np. preparatywna TLC lub chromatografia powinowactwa neomycyny.