DNA zakonserwowane w Jetsam whale ambergris

wprowadzenie

Ambergris, znany naturalny produkt kaszalota , znajduje się również jako jetsam na plażach na całym świecie i jest wysoko ceniony za swoją użyteczność w przemyśle perfumeryjnym . Chociaż od dawna uważano , że Ambra Jetsam zebrana na plażach pochodzi od kaszalotów, niewiele lub wcale na to nie zostało opublikowanych, a różnice istnieją między takimi próbkami i próbkami ambry pobranymi bezpośrednio od kaszalotów., Na przykład próbki ambry jetsam zawierają znacznie wyższe proporcje triterpenoidowej ambreiny alkoholowej i znacznie niższe proporcje steroli niż próbki ambry od kaszalotów . I odwrotnie, Jetsam ambergris czasami zawiera fragmenty dziobów kałamarnic, a ponieważ głowonogi, takie jak kałamarnice, stanowią główny składnik diety kaszalotów, przytoczono to jako dowód pochodzenia Jetsam coproliths od kaszalotów. Jest nawet teoretycznie Ambra może pochodzić jako patologiczna wydzielina z drażniącego chityny dzioba twardej kałamarnicy ., Jednak inne gatunki ssaków morskich (np. członkowie Globicephala i Ziphiidae) również przodują do kałamarnic, a niektóre (w tym karłowate i pigmejskie kaszaloty) są również wymieniane jako potencjalne źródła ambry . Dlatego, aby jeszcze bardziej wyjaśnić pochodzenie ambry jetsam, przeanalizowaliśmy DNA z próbki ambry pobranej od kaszalota na plaży w Holandii i porównaliśmy je z sekwencjami DNA wyizolowanymi z ambry Jetsam pobranej z plaż w Nowej Zelandii i Sri Lance.,

Ambra składa się głównie z ambreiny ze względu na jej produkcję z skwalenu, wspólnego produktu metabolicznego w wielu organizmach . Proces ten może być wywołany przez wpływ drobnoustrojów jelitowych i wytrąca się w gęstych, stałych masach w okrężnicy wieloryba . Akrecje koprolityczne, które wynikają, są kompozytowo dobrze dostosowane do zachowania DNA z jelita grubego, ponieważ ambreina jest hydrofobowa i najwyraźniej odporna na degradację w kwaśnym środowisku jelitowym., Dowody z datowania radiowęglowego z pewnością wskazują na odporność na drobnoustroje i degradację zdjęć w środowisku morskim przez okres do tysiąclecia w niektórych próbkach ambry jetsam . Postawiliśmy hipotezę, że taki materiał może stanowić odpowiedni schowek do zachowania DNA, nawet po długotrwałym narażeniu na szkodliwe warunki na morzu.

materiał i metody

zbadano okazy ambry Jetsam z Morza Północnego, Oceanu Indyjskiego i Pacyfiku, reprezentujące globalną dystrybucję materiału ., Trzy okazy ambry jetsam (jeden ze Sri Lanki, dwa z wyspy Pitt w Nowej Zelandii) poddano próbkowaniu do ekstrakcji DNA. Czwarty okaz pochodzi z sekcji samca kaszalota na plaży w grudniu 2012 roku w Razende Bol koło Texel w Holandii. Ta ostatnia „świeża” Ambra, pochodząca z potwierdzonej padliny kaszalota, dostarczyła znanego porównania do okazów jetsam z niepotwierdzoną historią biologiczną. Próbki ambry pozyskiwano i analizowano pod kątem zawartości ambreiny i sterolu w kale w poprzednich badaniach .,

ekstrakcja i sekwencjonowanie DNA zostały podjęte w GLOBE Institute, University of Copenhagen, w specjalnym laboratorium starożytnego DNA po rygorystycznych procedur minimalizacji zanieczyszczenia. Około 120 mg poddano próbkowaniu (rysunek 1 i Tabela 1) do ekstrakcji DNA. Próbki inkubowano w buforze zawierającym proteinazę k o pojemności 400 µl według Gilberta i wsp. w temperaturze 56°C przez 10 h; supernatanty były następnie poddawane działaniu fenolu i chloroformu, zgodnie z metodą Carøe i in., i oczyszczone za pomocą kolumn Monarch DNA Cleanup (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) zgodnie z wytycznymi producenta. Biblioteki dwuniciowe zostały zbudowane z ekstraktów DNA zgodnie z najlepszym protokołem, zaprojektowane i sprawdzone specjalnie do sekwencjonowania starożytnego i zdegradowanego DNA. Biblioteki zostały wzmocnione i indeksowane za pomocą PCR przy użyciu PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) zgodnie z wytycznymi producenta., Produkty były łączone w stężeniu równym przed sekwencjonowaniem na platformie Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA), przy użyciu 80 bp single end read chemistry w duńskim Narodowym Centrum sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości, Kopenhaga, Dania.

Tabela 1. Szczegóły dotyczące znalezisk próbek, masy oryginalnych koprolitów, masy podpróbkowane używane do ekstrakcji DNA oraz procentowy Składnik ambreiny (na podstawie frakcji rozpuszczalnej DCM).,
sample	location	całkowita masa (g)	analizowana masa (mg)	% ambrein
s. 01	Pitt Island, Nowa Zelandia	50	96	92
s.,02	Pitt Island, Nowa Zelandia	20	110	83
S.,03	Zachodnia Sri Lanka	101	188	60
TEXEL151212	Texel, Holandia	83000	92	93

tabela 2. Wyniki sekwencjonowania i wyrównania sekwencji dla P., macrocephalus mitochondrial i całego genomu odniesienia. Szacunki pokrycia są obliczane na podstawie unikalnych odczytów wyrównanych z sekwencjami odniesienia. Pomimo niskiego zasięgu dla S. 01, istnieją wystarczające dane dotyczące przypisania gatunku do P. macrocephalus, potwierdzone poniższym modelem filogenetycznym.,
sample	total aligned reades	średnia długość odczytu (bp)	total aligned reades (mtDNA)	czasy pokrycia (mtDNA)	całkowite wyrównane odczyty (cały genom)	czasy pokrycia (cały genom)
s.,01	77 261 083	72.9	43	0.175	12 782	0.0000546
s. 02	89 486 411	71.7	2440	1.648	26 169	0.000135
s.,03	71 907 406	68.3	40 235	9.717	2 447 082	0.00426
TEXEL151212	92 385 587	62.6	71 190	19.654	3 099 642	0.,00639

analiza sekwencji została przeprowadzona na wysokowydajnym obiekcie obliczeniowym na Uniwersytecie Kopenhaskim, z plikami FASTQ przetwarzanymi przy użyciu potoku PALEOMIX (V .1. 2. 13). FastQC V. 0.11.8 był początkowo używany do kontroli jakości surowych danych sekwencyjnych. Adaptery zostały przycięte przy użyciu AdapterRemoval V. 2.3.1, z odczytów mniej niż 25 bp również usunięte. Odczyty były następnie mapowane do sekwencji referencyjnych za pomocą BWA, również z zastosowaniem mapDamage2.,0 do podstawowego oznaczania ilościowego degradacji, tworząc wyrównania z sekwencjami odniesienia. ANGSD był następnie używany do produkcji sekwencji w formacie FASTA.

niepewność co do pochodzenia i biologicznych mechanizmów produkcji ambry skłoniła nas do rozważenia wielu potencjalnych gatunków waleni i pinniped w analizie sekwencji. Tożsamość gatunkowa została wywnioskowana na podstawie mapowania sukcesu i pokrewieństwa filogenetycznego z 19 gatunkami kandydującymi do NCBI RefSeq (zob. elektroniczny materiał uzupełniający)., Gatunki te zostały wybrane w oparciu o potencjalną przydatność jako głęboko nurkujące ssaki morskie wypełniające podobną niszę ekologiczną jak kaszaloty, aby wykluczyć współwystępowanie takich gatunków do produkcji ambry. Sekwencje próbne zostały połączone i wyrównane za pomocą MAFFT V. 7. 392 . Modele drzewa filogenetycznego zostały następnie wyprodukowane w MEGA X przy użyciu metody maksymalnego prawdopodobieństwa z Modelem Hasegawa-Kishino-Yano, z odległościami szacowanymi na podstawie podejścia maksymalnego prawdopodobieństwa kompozytowego (szczegóły wszystkich użytych sekwencji referencyjnych zawarte są w elektronicznym materiale uzupełniającym).,

wyniki

analizy filogenetyczne jednoznacznie potwierdziły pochodzenie plemników z czterech próbek ambry (ryc. 2; Elektroniczny materiał uzupełniający, ryc. S1). Podobnie, wyrównanie z mitochondrialnym genomem referencyjnym Physeter macrocephalus z NCBI (NC_002503.2) dało najwyższe wyniki pokrycia wszystkich próbek ze wszystkich wykonanych wyrównań i zapewnia pewną atrybucję, choć ze znaczącymi różnicami w sukcesie między próbkami. Sekwencjonowanie próbki splecionego kaszalota (TEXEL151212) o zdecydowanie największym zasięgu (ok., 20×) dla mitochondrium kaszalota, podczas gdy jedna z próbek jetsam z wyspy Pitt (S. 01) dawała tylko około 0,2 × pokrycia (patrz Tabela 2). Wyrównania z kogia sima (kaszalot karłowaty) i Kogia breviceps (kaszalot karłowaty) odwołują się do genomów mitochondrialnych (NC_041303.1, NC_005272 .1) również dały pokrycie (szczegóły w elektronicznym materiale uzupełniającym), chociaż wiele wysoce zachowanych regionów funkcjonalnych jest wspólnych dla analizowanych gatunków, co skutkuje wysokim podobieństwem sekwencji. Jednak zasięg dla kogiidów był zwykle około 10 razy mniejszy niż dla Physeter., Wyrównanie z P. macrocephalus całego referencyjnego genomu jądrowego (ASM283717v2) również się powiodło, choć jest to bardziej widoczne w porównaniu całkowitej liczby odczytów mapowanych do genomu. Wyrównanie do Architeuthis dux (kałamarnicy olbrzymiej ), powszechnie znanej ofiary kaszalotów (np.), nie powiodło się, ale nie jest to ich Dominująca zdobycz .

wyniki MapDamage pokazują niezwykle małą zmienność między próbkami wpływającą na przejścia C do T na końcach nici 5′, chociaż wyższy procent przejść G Do A na końcu 3′ istnieje dla S. 01 (szczegóły w elektronicznym materiale uzupełniającym, rysunek S2), wskazując na możliwą wyższą degradację biomolekularną., Ogólnie jednak, bardzo niewiele modyfikacji chemicznych miało miejsce, a rozkład zmian na pasmach pozostaje jednolity i płaski.

dyskusja

badanie to wykazało, że trzy próbki ambry jetsam można śmiało przypisać kaszalotowi poprzez ekstrakcję DNA. Chociaż potwierdzenie pochodzenia kaszalota dla Jetsam Ambra nie jest zaskakującym wynikiem, niniejsze badanie jest pierwszym w dostarczaniu znaczącego proof-of-concept W pobieranie endogennego DNA z ambry i z powodzeniem używać go do identyfikacji organizmu., Co ważne, pochodzenie wszystkich trzech badanych tu próbek Jetsam ambergris można śmiało zidentyfikować jako kaszalota na podstawie nie tylko sukcesu dopasowania genetycznego, ale także modelowania genomów mitochondrialnych w filogenetycznych drzewach pokrewieństwa, w tym dla dużej próbki outgroup taksonów ssaków morskich., Jednakże, chociaż wszystkie analizowane tutaj próbki zostały zidentyfikowane jako pochodzące od kaszalota, jest całkiem możliwe, że inne blisko spokrewnione głęboko nurkujące ssaki morskie (takie jak kaszaloty karłowate i pigmejskie) mogą wytwarzać ambrę i po prostu do tej pory nie zostały zarejestrowane.

Dominująca przyczyna dramatycznych różnic w zasięgu genetycznym obserwowanych między próbkami jest niejasna. Analiza degradacji DNA w mapDamage2.,0 wykazuje niewielką korelację z pokryciami wyrównań, jak można się spodziewać, a także niewielkie różnice między zawartością ambreiny w próbkach, które mogą przyczynić się do zachowania różnicowego DNA. Dokładny wiek obecnych próbek Jetsam nie jest znany, chociaż wcześniejsze badania z powodzeniem datowały radiowęglowo inne próbki ambry . Datowanie radiowęglowe stosunkowo niedawnych próbek jest jednak problematyczne ze względu na wpływ emisji paliw kopalnych , A daty radiowęglowe od wzrostu antropicznego uwalniania węgla są niewiarygodne., Uzyskanie spójnego tempa degradacji g do a w wiarygodnie datowanych starszych próbkach może w przyszłości pomóc w lepszym zrozumieniu różnicowego uszkodzenia DNA. Inną opcją dla przyszłych badań mogą być badania deamidacji glutaminy i racemizacji kwasu asparaginowego z analizy peptydów organicznych prawdopodobnie również obecnych w ambry . Alternatywnie, jednak, wewnątrz próbki zmiany w DNA i stężenia ambreiny może równie prawdopodobne, aby uwzględnić niski zakres w próbce S.,01, podczas gdy nowsze narażenie na tkankę kaszalotów niewątpliwie stanowi wysoki zasięg w próbce wieloryba na plaży TEXEL151212.

potencjał konserwujący ambreiny dla DNA rozciąga się nie tylko na endogenną genetykę wielorybów, ale także na metagenomiczny zasięg mikrobiomu jelitowego wieloryba, a potencjalnie także na DNA ich ofiary. Na przykład DNA może również pozostać w częściowo lub niestrawionych dziobach kałamarnicy znalezionych w kale kaszalota, a także w ambrze, które są nawet teoretyzowane jako patologiczna przyczyna wydzielania ambry ., Zrozumienie prokaryotic skład microbiome środowisko w Ambra może także dalej wyjaśniać pochodzenie Ambra, szczególnie w konwersji skwalen ambrein i proces który Ambra wydaje się tworzyć w warstwach akrecji. Dalsze analizy dotyczące endogennego pobierania DNA z ambry jetsam, w tym również DNA z mikrobioty jelitowej wieloryba i ofiary, dałyby znacznie większy wgląd w ekologię kaszalotów, ewolucję i metabolizm.,

wnioski

Jetsam Ambra od dawna jest materiałem enigmatycznym, od XVIII wieku przedmiotem dyskusji i analiz w publikacjach naukowych . To badanie jest pierwszym w naszej wiedzy, aby przedstawić ostateczne potwierdzenie biologicznego pochodzenia próbek ambry Jetsam jako kaszalotów, poprzez analizę DNA. Poza tym jednak, obecne badanie określa potencjał ambry jako nowego źródła danych genetycznych związanych z kaszalotami o znacznej długowieczności w czasie., Większe Wyjaśnienie pozostaje do osiągnięcia poprzez badanie warunków konserwujących DNA w ambreinie i różnicowych efektów z wielu czynników. Jednak potencjalne implikacje dla pomocy w zrozumieniu dynamiki populacji wielorybów i ich ekologicznie powiązanych taksonów mogą być głębokie. Najstarsze znane ambry Znalezione w osadach plejstoceńskich posiadają permineralizowane dzioby kałamarnic zawierające aminokwasy endogenne do kałamarnic, co autorzy przypisują zdolności konserwacyjne lokalnego osadu ., Chociaż jest mało prawdopodobne, że DNA zostanie zachowane w takim wieku (1,75 Ma), stwierdzenie to może być również przypisane skuteczności ambry i ambreiny jako substratów konserwujących. Wiele jest nadal nieznanych na temat ekologii i adaptacji morskich gigantów dawniej charakteryzowanych jako na wpół mityczne bestie, a Ambra może teraz okazać się małym, ale znaczącym kluczem do zrozumienia niektórych dalszych ich aspektów.

Etyka

wszystkie próbki zostały uzyskane i przeanalizowane etycznie w tym badaniu, będącym częścią projektu DNRF-128 PROTEIOS., Z czterech próbek ambry przeanalizowanych w tym badaniu, trzy (S. 01–S. 03) zostały podgrupowane z materiału badanego przez S. J. R. we wcześniejszych publikacjach (patrz wyżej), otrzymanego jako Ambra jetsam znaleziona na plażach (próbka nr ACL102-S. 01, acl103-S. 02 i ACL237-S. 03). Czwarta próbka (TEXEL151212) została uprzejmie dostarczona jako podpróbka okazu ambry TEXEL151212 przez Dr A. Oosterbaan w imieniu EcoMare Museum, Texel, Holandia, gdzie reszta tej próbki jest nadal przechowywana. Jesteśmy wdzięczni za zgodę Muzeum na wykorzystanie tej próbki.,

dostępność danych

wkład autorów

konkurencyjne zainteresowania

oświadczamy, że nie mamy konkurencyjnych interesów.

dofinansowanie

dofinansowanie zapewniła duńska Narodowa Fundacja badawcza Grant PROTEIOS (DNRF128).

podziękowania

R. M. jest wdzięczny Dr J. A. Samaniego za porady dotyczące analiz genomicznych, a także M. McCarthy za porady i dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Dr A. Oosterbaanowi (Ecomare Museum, Texel) za próbki S. 04 oraz anonimowym kolekcjonerom za próbki S. 01–S. 03., Autorzy pragną wyrazić uznanie dla pomocy duńskiego Krajowego Centrum sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w generowaniu danych Illumina.

Przypisy

elektroniczne materiały uzupełniające są dostępne online pod adresem https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.

opublikowane przez Royal Society na warunkach licencji Creative Commons Attribution Licensehttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, która pozwala na nieograniczone korzystanie, pod warunkiem, że oryginalny autor i źródło są wymienione.

Ottima