observatie
veel van de vooruitgang in de microbiologie is afhankelijk van de studie van “zuivere culturen.”Dit zijn culturen die slechts één type cel bevatten, idealiter met de cultuur afgeleid van een initiële enkele cel., Vanaf de vroege ontwikkeling van methodes voor het vestigen van zuivere culturen (1), zijn er vele voorbeelden geweest waarin culturen die aanvankelijk om zuiver werden beschouwd later werden gevonden om twee types van microben te bevatten. In sommige gevallen hebben deze onbedoelde multispecies-culturen geleid tot belangrijke doorbraken, zoals de ontdekking van waterstofoverdracht tussen soorten (2). Nochtans, met de komst van deep sequencing technologieën, zou het redelijkerwijs kunnen worden voorspeld dat onopgemerkt contaminanten in culturen niet langer een significante zorg zouden zijn.,
Geobacter sulfurreducens stam PCA werd halverwege de jaren negentig geïsoleerd door gebruik te maken van standaardverrijkings-en isolatietechnieken die verdunning tot extinctie in vloeibaar medium omvatten, gevolgd door herhaald strepen van geïsoleerde kolonies op een door agar gestolde medium (3). Dit is de klassieke strategie onderwezen in de meest populaire inleidende microbiologie handboeken (4-6). Later werd de stam DL1 van G. sulfurreducens verkregen door extra restreaking van geïsoleerde PCA-kolonies (7). Met de ontwikkeling van methoden voor de genetische manipulatie van G. sulfurreducens (7) en de sequencing van zijn genoom (8), G., sulfurreducenen werden de gekozen Geobacter-soorten voor de studie van de fysiologie en nieuwe extracellulaire elektronenoverdracht-eigenschappen van dit uit milieuoogpunt belangrijke geslacht (9). De eerste sequencing van het 16S rRNA-gen in de kweek (3), evenals de sequencing van het genoom eerst tot 8-voudige (8) en vervolgens tot 80-voudige (10, 11) dekking, gaf aan dat de kweek slechts één stam bevatte.,
in een poging om DL1 adaptief te ontwikkelen om meer stroom te produceren, werd het geïnoculeerd in een bio-elektrisch systeem met een grafietanode op een potentiaal (-400 mV versus Ag/AgCl) die geacht wordt dicht bij de ondergrens te liggen waarbij stroomopwekking uit acetaat mogelijk zou zijn (12). Een isolaat verkregen uit de anode biofilm, aangeduid met G., sulfurreducens stam KN400 (12), is superieur aan de entmateriaal stam in het produceren van elektrische stroom, en deze superioriteit wordt ten minste gedeeltelijk toegeschreven aan zijn vermogen om meer “microbiële nanodraden,” elektrisch geleidende eiwit filamenten die metaal-achtige elektrische geleidbaarheid vertonen produceren (13, 14).
aanvankelijk werd aangenomen dat Stam KN400 een of meer mutaties had opgebouwd die de capaciteit voor extracellulaire elektronenoverdracht versterkten., Dit zou analoog zijn aan de selectie voor mutantstammen tijdens de adaptieve evolutie van Stam DL1 voor elektronenuitwisseling met andere organismen (11) of hogere reductiesnelheden van Fe(III) oxide (10). Vergelijkende genomica onthulde echter dat de genoomsequentie van Stam KN400 meer dan 27.270 enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNPs) bevatte (15). Een derde van de genen had ten minste één nucleotidepolymorfisme, en een kwart had een polymorfisme dat de resulterende eiwitvolgorde beïnvloedde (15). Gebaseerd op typische mutatiesnelheden van 6.,3 × 10-9 / bp per generatie (16), zou het meer dan 1000 jaar duren om zoveel mutaties in stam DL1 te accumuleren. Verder zijn er geen orthologen in de DL1-stam voor 139 van de open reading frames (ORFs) in het genoom van de KN400-stam, waarvan de meeste het nauwst verwant zijn aan genen in fylogenetisch diverse organismen (15).
deze overwegingen en het feit dat de voor KN400 unieke ORF ‘ s niet werden gedetecteerd toen de entkweek opnieuw werd vastgesteld (10, 11) leidden tot de hypothese dat KN400 als contaminant in het Bio-elektrochemische systeem terecht kwam., Om deze mogelijkheid te evalueren, werd de zuiverheid van de DL1-cultuur verder beoordeeld met een nog hogere gevoeligheid.
zowel DL1 als KN400 bevatten OMC ‘ s, een gen voor een cytochroom aan de buitenkant dat een van de hoogste percentages SNPs (36 SNPs/kb) tussen de twee stammen heeft (15). Dit gen werd vergroot van de DL1-cultuur die was gebruikt om het Bio-elektrochemische systeem in te enten, en de PCR-producten werden gerangschikt met Illumina Hi-Seq 2000 (zie tekst S1 in het aanvullende materiaal)., De kn400-sequentie werd gedetecteerd, wat erop wijst dat KN400 aanwezig was in het initiële entmateriaal dat werd gebruikt voor de anode-selectiestudie. Van de>107 teruggewonnen sequenties van hoge kwaliteit waren er echter slechts 286 KN400-sequenties versus 1,5 × 107 DL1-sequenties (Tabel 1).
tekst S1
Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licentie, die onbeperkte niet-commerciële gebruik, distributie en reproductie toestaat in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.,
- View inline
- View popup
schattingen van de abundantie van Stam KN400 in verschillende culturesa
tabel S1
Dit is een open-access artikel verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Unported licentie, die onbeperkte niet-commerciële gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.
De relatieve abundantie van de kn400-stam in dezelfde kweek werd verder geëvalueerd door middel van kwantitatieve PCR (qPCR) met een primerset specifiek voor een gen dat alleen in KN400 wordt aangetroffen (zie tekst S1 en tabel S1 in het aanvullende materiaal) en een primerset die zowel KN400 als DL1 detecteerde (zie tabel S1 in het aanvullende materiaal)., De relatieve abundantie van de KN400 – specifieke sequentie was vergelijkbaar met die van de KN400 OMCS-sequenties bepaald door de sequentiebenadering (Tabel 1). De opeenvolgingsanalyse en qPCR-analyse van de PCA-cultuur die bij ATCC wordt gedeponeerd onthulden de aanwezigheid van KN400 bij een gelijkaardige lage overvloed (Tabel 1).
we hebben geprobeerd de zeldzame kn400-contaminant uit de DL1-cultuur te verwijderen door geïsoleerde kolonies die op gestolde acetaat-fumaraatmedium zijn gekweekt, herhaaldelijk opnieuw te verwijderen (7), maar de kn400-stam bleef in de geïsoleerde kolonies met een lage frequentie aanhouden (Tabel 1)., Een kweek waarin KN400 niet meer kon worden gedetecteerd, werd echter verkregen in vloeibaar acetaat-fumaraat (zie tekst S1 in het aanvullende materiaal) waarin de hoogste verdunning die groei vertoonde, werd onderworpen aan verschillende opeenvolgende opeenvolgende verdunningen (Tabel 1). Dit toonde aan dat de DL1-stam niet de zeldzame aanwezigheid van KN400 vereist om te groeien in het acetaat-fumaraat-medium waarop deze cultuur routinematig wordt gehandhaafd.
wanneer zuivere KN400 en de KN400-vrije DL1-cultuur in gelijke hoeveelheden in acetaat-fumaraat werden geïnoculeerd, werd KN400 door DL1 overtroffen (Fig., 1 bis). Dit komt overeen met de bevinding dat wanneer de twee stammen afzonderlijk werden gekweekt, DL1 veel sneller groeide dan KN400 (optische dichtheid bij 600 nm van 0,04 voor KN400 versus 0,65 voor DL1 na 36 uur incubatie; zie Fig. S2 in het aanvullende materiaal) in hetzelfde medium. Het aandeel KN400 bleef dalen met opeenvolgende overdrachten (1% entmateriaal) totdat de abundantie van KN400 vergelijkbaar was met die in de PCA-en DL1-voorraadculturen (zie tekst S1 in het aanvullende materiaal). KN400 bleef op dit lage niveau met verdere transfers (Fig. 1 bis).,
figuur S2
Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licentie, die onbeperkte niet-commerciële gebruik, distributie en reproductie toestaat in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.,
groei en activiteit van Stam KN400 onder verschillende groeiomstandigheden. (a) relatieve abundantie van KN400 in opeenvolgende mid-log transfers (1% entmateriaal) van een cultuur geïnitieerd met gelijke verhoudingen van KN400 en DL1. De resultaten zijn de middelen en standaardafwijkingen van drievoudige culturen. b) de huidige produktie toen de DL1-cultuur in de anodekamer van een bio-elektrochemisch systeem met een grafietanode op -400 mV T.O. V. Ag/AgCl werd gebracht. De KN400 – vrije cultuur produceerde geen stroom in deze tijd., (C) relatieve abundantie van KN400 in anode biofilms wanneer het initiële entmateriaal de DL1 cultuur was die later ook KN400 bleek te bevatten. De resultaten zijn de middelen en standaardafwijkingen van drievoudige culturen.
herhaalde pogingen om de KN400-vrije DL1-cultuur op een anode van -400 mV te kweken, waren niet succesvol. Echter, stroom werd gemakkelijk geproduceerd in een andere reeks experimenten waarin de DL1 cultuur met KN400 diende als entmateriaal (Fig. 1 ter)., Een qPCR-analyse van DNA uit de anode-biofilm wees erop dat 100% van de OMCS-sequenties KN400 waren binnen de tweede overdracht (Fig. 1c). Deze resultaten suggereren dat de reden waarom KN400 op de anodes kwam was dat de DL1 stam niet in staat was om te groeien onder de opgelegde voorwaarden. Zonder deze ongebruikelijke selectieve druk, zou KN400 onopgemerkt in de PCA en DL1 culturen zelfs door momenteel beschikbare volgende-generatie het rangschikken methodes zijn gebleven die in theorie duizendvoudige dekking in genoom het rangschikken kunnen verstrekken.,
de factoren die bijdragen aan de langdurige persistentie van Stam KN400 bij extreem lage frequentie in de DL1-cultuur blijven een mysterie. Het belang van het fysisch isoleren van afzonderlijke cellen door methoden die definitiever zijn dan het streaken op een vast medium om zuivere culturen vast te stellen wordt al enige tijd erkend (17), en steeds meer verfijnde methoden om dit te bereiken worden nog steeds ontwikkeld (18-23)., Echter, de plating methoden die in gebruik zijn geweest voor meer dan 100 jaar en worden onderwezen aan elke student microbiologie als standaard procedures voor het verkrijgen van zuivere culturen (4-6) blijven de meest voorkomende. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat cryptische contaminanten zonder eencellige isolatie op zeer lage frequentie kunnen overleven in culturen gedurende tientallen jaren van intensief onderzoek en kunnen ontsnappen aan detectie door zelfs de meest geavanceerde sequentiemethoden die momenteel beschikbaar zijn.,
figuur S1
Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported licentie, die onbeperkte niet-commerciële gebruik, distributie en reproductie toestaat in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.,