3.1.2.2. HPLC
HPLC met behulp van mobiele fasen op basis van acetonitril of hexaan maakt de directe detectie van fosfolipiden mogelijk zonder voorafgaande reiniging van het ruwe extract, waardoor deze methoden eenvoudig en snel zijn. Deze methoden scheiden echter niet effectief de verschillende inositolfosfolipiden. Nakamura et al. (1989) hebben een HPLC-procedure ontwikkeld die specifiek ptdins en PtdInsP2 in de hersenen analyseert., Bij deze methode wordt het lipide-extract eerst afgeleid met 9-anthryldiazomethaan om (9-anthryl) PtdInsP en di(9-anthryl) PtdInsP2 te produceren en vervolgens wordt het afgeleide Monster gescheiden door HPLC met UV-detectie bij 245 nm. PtdCho, PtdIns, Ptdser, PtdEtn en SM worden niet afgeleid van dit reagens en interfereren daarom niet met de bepaling (Yamada et al., 1988). Deze methode is gevoeliger dan de ondergeivatiseerde UV-detectiemethode voor de analyse van de inositolfosfolipiden.
Low (1990) beschrijft het gebruik van deae-cellulosekolommen voor preparatieve HPLC van hersenlipiden., De fosfolipiden in de hersenen opgelost in 50 ml oplosmiddel a (chloroform/methanol/H2O, 20: 9: 1, vol.) en toegepast op de cellulose kolom (deae cellulose, Sigma), die wordt gewassen met alkali en zuur neutraliteit. De gewassen deae cellulose is verpakt in een glazen kolom (2 cm × 38 cm) met oplosmiddelbestendige hulpstukken. De kolom wordt vervolgens geëlueerd met een debiet van 100 ml/uur met 1 1 lineaire gradiënt van 100% oplosmiddel A tot 100% oplosmiddel B (oplosmiddel A bevat 0,6 M ammoniumacetaat) en 13-15 ml fracties worden verzameld en geanalyseerd voor fosfor (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolatie van PtdInsPs uit runderhersenen door een deae-cellulose kolomchromatografie. Met zuur gewassen methanol-geprecipiteerde Folchfractie werd geëlueerd uit een kolom van DEAE-cellulose met een gradiënt van 100% oplosmiddel a (chloroform/mefhanol/H2O, 20: 9: 1, vol.) tot 100% oplosmiddel B (oplosmiddel A bevat 0,6 M ammoniumacetaat) en 13-15 ml fracties verzameld. De fracties werden onderzocht op organische fosfor. De gemiddelde recovery van Toegepaste organische fosfor bedroeg ongeveer 90%., De piek eluting bij breuk nummer. 25 was reproduceerbaar aanwezig, maar werd niet geïdentificeerd. De samenstelling van de pieken werd bepaald door TLC-analyse van gepoolde fracties. Pieken worden geïdentificeerd zoals aangegeven in de figuur.
gereproduceerd uit Low (1990) met toestemming van de uitgever.
als alternatief voerde Low (1990) de chromatografische stap uit met preparatieve HPLC met behulp van een aminokolom. De fosfolipiden in de hersenen werden opgelost in 5 ml oplosmiddel A en werden aangebracht met een stroomsnelheid van 2.,5 ml / min tot een amino – NP-kolom van 10 mm × 250 mm (5 µm sferisch silica met n-propylamine-bindfase, IBM Instruments, Danbury, CT) met een beschermkolom van 4,5 mm × 50 mm die is geëquilibreerd met oplosmiddel A. De kolom wordt geëlueerd bij een debiet van 2,5 ml/min met 25 ml oplosmiddel a, een 125 ml gradiënt van 100% oplosmiddel A tot 100% oplosmiddel B, en 100 ml 100% oplosmiddel B; 5 ml fracties worden verzameld. De samengevoegde fracties worden geconcentreerd door aanpassing tot 18 ml met oplosmiddel A en de fosfolipiden geëxtraheerd. De gemiddelde terugwinning van organische fosfor is 80%., Een volledige scheiding van PtdIns (90 ml), ptdinsp (150 ml) en PtdInsP2 (160-200 ml) werd verkregen (chromatogram niet getoond). De PtdIns overlappen echter met PtdSer. De samenstelling van de pieken werd bepaald met TLC van gepoolde fracties.
Low(1990) heeft ook een HPLC-zuivering beschreven van de gelabelde ptdinen(4)p en Ptdinen (4,5)P2 uit humane bloedplaatjes. Het lipide-extract uit bloedplaatjes werd bereid uit 60 ml vers menselijk bloed in de aanwezigheid van methanol neergeslagen runderen hersenen PtdInsPs als drager, wordt uiteindelijk opgelost in 0.,De kolom wordt geëlueerd met 5 ml oplosmiddel A (een lineaire gradiënt van 25 ml van 100% oplosmiddel A tot 100% oplosmiddel B) en 20 ml oplosmiddel B. Een milliliterfracties worden verzameld en de radioactiviteit wordt bepaald door het tellen van vloeibare scintillatie. De gemiddelde terugwinning van de toegepaste radioactiviteit is ongeveer 70%. Er is een uitstekende resolutie van de drie inositolfosfatiden, maar de PtdIns overlappen met PtdOH., Daarom is deze HPLC-procedure niet geschikt voor de bereiding van PtdIns aangezien PtdOH, die in de meeste celtypes sneller door Pi wordt geëtiketteerd, niet van het wordt opgelost. Het is waarschijnlijk dat andere anionische fosfolipiden zoals PtdSer door de amino-NP-kolom slecht zullen verdwijnen uit Ptdines, zoals waargenomen met de DEAE-cellulose-procedure.
zoals hierboven besproken, is geen van de bovengenoemde methoden effectief bij het scheiden van de afzonderlijke PtdInsPs in zuivere vorm van ruwe weefselextracten. Daarom moeten de lipide-extracten door verschillende chromatografische stappen worden verwerkt., Hiertoe wordt het extract eerst onderworpen aan sephadexchromatografie voor scheiding van de lipiden van de nonlipiden in het extract. De lipidefractie wordt dan op een DEAE-kolom gegoten die met verschillende oplosmiddelen wordt geëlueerd. De PtdInsPs worden door elutie met chloroform/methanol/ammoniumzout als laatste elutiestap teruggewonnen. De afzonderlijke fracties worden geconcentreerd tot 100 µl bij 45°C onder stikstof en vervolgens wordt het geconcentreerde residu verder gescheiden door cartridge-kolomchromatografie, TLC, HPLC of andere chromatografische procedures.,
Singh(1992) beschrijft de extractie en analyse van PtdIns, Ptdins(4)P en Ptdins (4,5)P2 met behulp van een Sep-Pak cartridge. Een totaal lipide-extract (Folch et al., 1957) van Rath brain synaptosomes en microvessels werd eerst bereid en de eerste fractie gegenereerd (fractie 1) werd verzameld en verder geëxtraheerd tot afzonderlijke fosfolipiden en glycolipiden zoals beschreven door Dugan et al. (1986). De fosfolipidefractie werd onderworpen aan deae-cellulose chromatografie (scheidingssequentie 4) zoals beschreven door Rouser et al. (1969) om de inositollipiden verder te zuiveren., Het gezuiverde extract werd overgebracht naar een Sep-Pak patroon. Verschillende inositollipiden worden uit de kolom geëlueerd met een lineaire gradiënt van ammoniumacetaat en water van 0,5% ammoniumacetaat (200 mM) en 99,5% water tot 75% ammoniumacetaat en 25% water in 60 minuten bij een debiet van 0,5 ml/min (zie hoofdstuk 2). Het kolom-eluaat gedurende 120 minuten werd verzameld in fracties van 1 ml. Verschillende pieken werden geïdentificeerd door ptdins, Ptdins(4)P en Ptdins(4,5)P2 pieken als referentiepunten te gebruiken., De fracties met individuele inositollipiden werden samengevoegd en geanalyseerd door HPLC zoals beschreven door Geurts van Kessel et al. (1977). Individuele fosfolipiden werden gedetecteerd bij 206 nm met behulp van een diode array detector geprogrammeerd om een 200-350 nm bereik te scannen. Singh (1992) heeft 50-90% terugwinning van ptdins en InsPs van hersenensteekproeven aangetoond. InsP3 en InsP4 vertoonden het laagste herstel door een slechte kwantificering in plaats van een slechte extractiemethode. De cartridgemethoden zijn niet toegepast voor de isolatie van de PtdIns(3)P, Ptdins(3,4)P2 en Ptdins (3,4,5)P3.
Cronholm et al., (1992) hebben de isolatie van ptdinsps van rat pancreas beschreven. Elke alvleesklier werd onmiddellijk gehomogeniseerd in 3 ml chloroform / methanol (1:2, v / v), en ongeveer 3 MBq van 3h-gelabelde PtdIns(4)p of Ptdins(4,5) P2 werden toegevoegd samen met 0,6 ml van 1,2 aq. HCl vóór extractie met chloroform, zoals beschreven door Schacht (1981). Methanol werd toegevoegd aan de gepoolde en gewassen extracten om chloroform/methanol te produceren (3:2, v/v). De oplossing werd toegepast op de Lipidex-deae kolom, en de meeste lipiden werden geëlueerd met chloroform / methanol (3: 2, v/v) of chloroform/methanol / water (3:6:1 door vol.)., PtdIns en PtdSer werden samen met 0,03 M H3PO4 en ongeïdentificeerd materiaal met 0,1 M H3PO4 geëlueerd. Ptdin(4)P werd geëlueerd met 0,25 M H3PO4 en Ptdin (4,5)P2 met 0,5 M H3PO4, zoals aangegeven door de geëlueerde radioactiviteit. Alle fracties werden geëxtraheerd met 0,4 ml water/ml eluaat. De bovenste fase werd terug geëxtraheerd met 0,1 vol. chloroform. De gepoolde chloroformfasen werden gewassen met 0,4 vol. van 0,5 m HCl in 50% aq. methanol. De fracties werden gebruikt voor de bepaling van moleculaire species door FAB/MS (zie hieronder).
Gunnarsson et al., (1997) gebruikte normale fase HPLC met evaporative light scattering detectie voor de analyse van commerciële monsters van PtdInsPs samen met andere fosfolipiden. Met behulp van een lineaire gradiënt van A, chloroform / methanol / ammoniak (50: 45: 3, vol.) en B, chloroform / methanol / water / ammoniak (25: 55: 17: 3, vol.) goed opgeloste laat opkomende pieken voor PtdIns(4)P en Ptdins(4,5)P2 worden verkregen. De dosisresponscurves voor PtdIns(4)P en Ptdins(4,5)P2 waren niet lineair, wat kenmerkend is voor de lichtverstrooiingsdetector (resultaten niet getoond)., Voor de meeste doeleinden is de HPLC-techniek superieur in resolutie, snelheid en algemeen gemak aan de DEAE-cellulose-procedure en is de methode van keuze als HPLC-materiaal beschikbaar is. Deae-cellulose is goedkoop en grootschalige zuivering kan het gebruik van dit materiaal vereisen. De HPLC-procedure is ook superieur aan sommige of in alle opzichten aan alternatieve procedures voor de zuivering van polyfosfoinositiden, bijvoorbeeld preparatieve TLC-of neomycine-affiniteitchromatografie.