figuur 1. Drie geselecteerde stilstaande beelden uit een film van polo-uitgeputte cellen laten duidelijk zien dat, na verloop van tijd, intense centromeer/kinetochore signaal (rood) oplost in een paar punten, die aantoont dat chromosomen syntelically verbonden zijn met spindle microtubuli (groen). 4D de datasets van de fluorescentiemicroscopie werden verzameld om de 30 seconden met 0.,5 mm z-stappen die het volledige celvolume met behulp van een 100°, 1.4 na plan-apochromatische doelstelling bij 25°C met Andor ‘ s Revolution spinning disk confocal unit en iXon EMCCD camera, beide aangedreven door Andor IQ live-cell imaging software.

mitotische celdeling berust op het vermogen van cellen om zusterchromatiden goed te verdelen in vormende cellen. Om de functiecellen betrouwbaar uit te voeren gebruiken interne bewerkingsmechanismen om onjuiste chromosoom / spindelvezel bijlagen te corrigeren., Gepaarde kinetochores zijn meestal uitgelijnd om goed te hechten spindelvezels en scheiden chromatine, echter, foutieve en verkeerd uitgelijnd kinetochores doen resultaat. Cellen bevatten gespecialiseerde bewerkingsmechanismen om deze verkeerd uitgelijnde kinetochoorparen te voorkomen en te corrigeren, hoewel het exacte mechanisme niet goed wordt begrepen 1,2 ., Het wordt gepostuleerd door Tatiana Moutinho-Santos aan de Universidade do Porto, Portugal Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC) dat de aanwezigheid van POLOKINASE noodzakelijk is om chromosoom bi-oriëntatie (genoemd amfitelische rangschikking) te bevorderen en daardoor de juiste kinetochore uitlijning te behouden.om een beter inzicht te krijgen in zijn rol bij het reguleren van kinetochore ontwikkeling, bestudeerde Dr.Moutinho dos Santos het uitgeputte Drosophila POLOKINASE in levende cellen om POLO ‘ s betrokkenheid bij de bewerkingsfuncties te onderbouwen die nodig zijn om de amfitelische kinetochore opstelling te handhaven., In dit geval werd de syntelische regeling (zusterkinetochoren verbonden aan microtubuli afkomstig van dezelfde spindel) bestudeerd. Timelapse analyse van mitose werd uitgevoerd op Drosophila S2 cellen stabiel expressie CID-mCherry voor visualisatie van de centromeren, en GFP-a-tubuline voor de microtubuli. De visualisatie van kinetochores eist wegens hun kleine grootte, lage fluorescente signaal en korte verschijning tijdens celdeling. Confocal de fluorescentiemicroscopie wordt vaak gebruikt aan beeldkinetochores, nochtans, zelfs in dit milieu, blijft visualisatie moeilijk., De kinetochores zijn zeer klein (300 nm)3, dicht bij de laterale oplossende mogelijkheden van de lichte microscoop, en overschrijden de axiale oplossende capaciteit van de microscoop. Bovendien stelt de weergave fluorescente tellers binnen levende cellen potentiële fototoxische en photobleaching gevolgen. De Intense laserverlichting kan fototoxiciteitsproblemen veroorzaken, vooral schadelijk voor het leven, die cellen verdelen.

Andor ’s Revolution XD spinning disk confocale microscopie wordt gebruikt om Dr.Moutinho dos Santo’ s unieke uitdaging geassocieerd met de observatie van kinetochores te overwinnen., In dit geval moeten vier afzonderlijke factoren gelijktijdig worden aangepakt om de dynamische cellulaire processen adequaat te visualiseren:

  • acquisitiesnelheid
  • spatial and temporal resolving capability
  • het vermogen om zeer lage fluorescentie intensiteitsniveaus
  • beheer van beschikbaar fluorescentiesignaal

Deze thema ‘ s van ruimtelijke, temporele en intensiteitsresolutie komen vaak terug met fluorescentiemicroscopie en staan vaak haaks op experimenten waarbij de levensvatbaarheid van cellen wordt geobserveerd., Bijvoorbeeld, de lange blootstelling van de camera en de lange periodes van hoge intensiteitsbelichting veroorzaken de fototoxische gevolgen die levende cellen beschadigen of vernietigen. Tegelijkertijd vereisen licht geëtiketteerde microstructuren langere blootstelling om te visualiseren, maar kan negatief worden beïnvloed door photobleaching. Het probleem wordt nog verergerd door de noodzaak om traditionele driedimensionale gegevens te combineren met die van de tijd. Tot slot blijft het noodzakelijk om signaal van achtergrondruis en onscherpe waas te onderscheiden.

acquisitiesnelheid is van bijzonder belang voor Dr.Mountinho dos Santos., Controle-S2-cellen vertonen een delingscyclus van ongeveer 30 minuten. Echter, de Polo uitgeputte S2 cellen gebruikt in haar experimenten toonde een arresteerde periode van meer dan acht uur. Het opnemen van de Polo-verarmde celdeling vereist het verzamelen van tussen de 7.200 en 12.000 beeldsets (twee fluorochromen afgebeeld elke dertig seconden gedurende een tot vijf uur, verkregen bij 0,5 micron axiale stappen bij maximaal 20 stappen voor axiale kinetochore resolutie)., De conventionele fluorescentiemicroscopie en de laserverlichting zullen noch de noodzakelijke zachte verlichtingsvereisten noch de snelheid van aanwinst toestaan om deze tijdgevoelige taak te voltooien. Bijvoorbeeld vereist de laser die in traditionele confocal microscopie rasteren langere tijdsperioden tijd om signaal van de steekproef te verzamelen. Het spinnen disk confocal systemen worden gebruikt om deze traditionele barrières te overwinnen en om nieuwe inzichten in moleculaire kinetochore het uitgeven technieken te onthullen.,

vergeleken met conventionele Widefield-fluorescentiesystemen is de ruimtelijke resolutie van een confocale draaiende schijf superieur in zowel laterale (x en y) als axiale (z) dimensies. Door het constante aftasten van de pinhole serie, kunnen de steekproeven in real-time bij hoog contrast worden bekeken, die duidelijke beelden bij de diffractiegrenzen van de optica van de microscoop verstrekken. Dit maakt de 3D visualisatie en het begrip van het dynamische gedrag van de kinetochoor in relatie tot de microtubules van de as mogelijk., Kinetochore en centromeer laterale resolutie van 300 Nm en spindelvezel resolutie van 300-500 nm werden gerapporteerd en zijn gedetailleerd in Figuur A.

Intensiteitsresolutie
het visualiseren van de fluorescerend gelabelde kinetochoren geassocieerd met elke centromeer stelt extra eisen aan het acquisitiesysteem. De centromeren en kinetochoren die worden bestudeerd, zijn hoofdzakelijk alleen zichtbaar tijdens de celdelinginterfase. Aangezien de cellen door profase overgaan, hebben centromeren zich reeds in typische twaalf chromosoomparen van Drosophila opgelost., Het beheer van het beschikbare lichtbudget tijdens langdurige acquisitie vereist zachte verlichting en hoge resolutie staat door draaiende schijftechnieken. De openingen binnen de draaiende schijf bieden deze voordelen. Omdat het licht fluorophores slechts opwekt wanneer een opening aanwezig is, worden de fototoxische gevolgen geminimaliseerd. Hoewel contra-intuïtief, wijst een verminderd licht budget niet op zwakke, moeilijk te detecteren objecten. De intensiteitsresolutie wordt verhoogd door de uitsluiting van het onscherpe signaal van de draaiende schijf en de daaropvolgende signaalversterking door een EMCCD-cameraarchitectuur., Dit creëert de nieuwe mogelijkheid om beelden met een hoger contrast te genereren die de ontwikkeling en uitlijning van punctate objecten zoals kinetochores laten zien.

conclusies
het gebruik van spinning disk technologie in Dr.Mountinho dos Santos live cell applicatie leidde tot een belangrijke observatie. Bij afwezigheid van het POLOKINASE bleken de Drosophilacellen niet over de corrigerende mechanismen te beschikken die nodig zijn om de amfitelische chromosoomindeling te handhaven., De aanwezigheid van POLO werd getoond om de juiste omgeving voor correcte centromeer architectuur te verstrekken, terwijl tegelijkertijd correcte chromosoom bi-oriëntatie verzekeren. Gekweekte Drosophila cellen die mitose ondergaan bij afwezigheid van polokinase chromosomen hechten aan spindelvezels met syntelic oriëntatie, d.w.z., met Zuster kinetochores in bijlage aan microtubules die van één enkele spindelpool komen.

deze conclusie werd getrokken door zorgvuldige analyse van 4D fluorescentiemicroscopie in cellen die fluorescent gelabelde centromeer/ kinetochore marker en microtubuli tot expressie brengen. (Figuur 1).