Inleiding
Ambergris, een bekend natuurproduct van de potvis , wordt ook wereldwijd als jetsam aangetroffen op stranden en is zeer gewaardeerd om zijn nut in de parfumindustrie . Hoewel al lang wordt beweerd dat de jetsam ambergris die op stranden worden verzameld afkomstig is van potvissen , is er nooit of nauwelijks bewijs hiervoor gepubliceerd, en er bestaat een onderscheid tussen dergelijke monsters en monsters van ambergris die rechtstreeks van potvissen worden genomen., Bijvoorbeeld, jetsam ambergris monsters bevatten over het algemeen veel hogere proporties van de triterpenoïde alcohol ambrein en veel lagere proporties van sterolen dan monsters van ambergris van potvissen . Omgekeerd echter, jetsam ambergris soms bevat fragmenten van pijlinktvis snavels, en aangezien koppotigen, zoals pijlinktvissen, vormen de belangrijkste voedingscomponent van potvissen, is dit aangehaald als bewijs van een oorsprong van de jetsam coprolieten van potvissen. Het is zelfs getheoretiseerd ambergris kan ontstaan als een pathologische afscheiding van de irriterende van de harde inktvis snavel chitine ., Andere zeezoogdieren (b .v. leden van Globicephala en Ziphiidae) komen echter ook voor op pijlinktvissen , en sommige (waaronder dwergvinvissen en pygmee potvissen) worden ook genoemd als mogelijke bronnen van ambergris. Om de oorsprong van jetsam ambergris verder te verduidelijken, hebben we DNA geanalyseerd van een ambergrismonster dat werd verzameld van een potvis die in Nederland strandde en vergeleken met DNA-sequenties geïsoleerd uit jetsam ambergris die werden verzameld op stranden in Nieuw-Zeeland en Sri Lanka.,van Ambergris wordt aangenomen dat het voornamelijk bestaat uit ambreïne vanwege de productie uit squaleen, een veel voorkomend metabolisch product in veel organismen . Dit proces kan worden veroorzaakt door microbiële invloed in de darm, en precipiteert in dichte, vaste massa ‘ s in de dikke darm van de walvis . De coprolitic accretions die resulteren zijn compositorisch goed geschikt voor het behoud van DNA van de dikke darm aangezien ambrein hydrofoob is en blijkbaar bestand tegen degradatie binnen de zure enterische omgeving., Bewijs van koolstofdatering wijst zeker op resistentie tegen microbiële en foto-degradatie in het mariene milieu tot een millennium in sommige jetsam ambergris monsters . We veronderstelden dat dergelijk materiaal een geschikte cache zou kunnen bieden voor het behoud van DNA, zelfs na langdurige blootstelling aan schadelijke omstandigheden op zee.
materiaal en methoden
jetsam ambergris-specimens uit de Noordzee, de Indische Oceaan en de Stille Oceaan werden geanalyseerd en vertegenwoordigen de wereldwijde verspreiding van het materiaal ., Drie jetsam ambergris specimens (één uit Sri Lanka, twee uit Pitt Island, Nieuw-Zeeland) werden gesampled voor DNA-extractie. Een vierde exemplaar is afkomstig van de dissectie van een mannelijke potvis die in December 2012 strandde bij Razende Bol bij Texel. De laatste’ verse ‘ ambergris, afkomstig van een bevestigd potviskarkas, leverde een bekende vergelijking op met de jetsam specimens met een onbevestigde biologische geschiedenis. In eerdere studies werden monsters van ambergris verkregen en geanalyseerd op het gehalte aan ambreïne en fecale sterol .,
DNA-extractie en-sequencing werden uitgevoerd aan het GLOBE Institute, Universiteit van Kopenhagen, in een speciaal oud DNA-laboratorium volgens strikte procedures voor het minimaliseren van contaminatie. Ongeveer 120 mg werd gesubstamped (figuur 1 en Tabel 1) voor DNA-extractie. Monsters werden geïncubeerd in 400 µl proteïnase K-bevattende buffer na Gilbert et al. bij 56°C gedurende 10 uur; de supernatanten werden vervolgens behandeld met een fenolchloroform stap na Carøe et al., en gezuiverd met Monarch DNA Cleanup kolommen (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Double-stranded bibliotheken werden gebouwd van DNA-extracten die het beste protocol volgen, ontworpen en bewezen specifiek voor het rangschikken van Oud en gedegradeerd DNA. Bibliotheken werden uitgebreid en geïndexeerd via PCR met behulp van PfuTurbo CX Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) volgens de richtlijnen van de fabrikant., De producten werden gepoold bij equimolaire concentratie alvorens op een platform van Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) te rangschikken, gebruikend 80 BP single end read chemistry bij het Deense Nationale Centrum van de rangschikking van het hoog-productiedna, Kopenhagen, Denemarken.
figuur 1. Gegevens over de geanalyseerde ambergrismonsters. (a) kaart met de plaatsen waar de monsters van ambergris oorspronkelijk werden gevonden., (b) Foto ‘ s die een grote diversiteit in fysieke kenmerken van fragmenten van ambergris laten zien: TEXEL151212 (van ontleed walvis specimen) was korrelig in consistentie, terwijl jetsam monsters oppervlakkig dichter en heterogeen leken, inwendig equigranulair waren en aanzienlijk bleker van kleur.
| voorbeeld | locatie | de totale massa (g) | geanalyseerd massa (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Island, Nieuw-Zeeland | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | westen van Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Nederland | 83000 | 92 | 93 |
| sample | totaal behouden leest | Gemiddelde behouden leeslengte (bp) | Total aligned reads (mtDNA) | times of coverage (mtDNA) | Total aligned reads (whole genome) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | inves teren 72,9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Sequentieanalyse werd uitgevoerd op de high-performance computing facility van de Universiteit van Kopenhagen, waarbij FASTQ-bestanden werden verwerkt met behulp van de PALEOMIX-pijplijn (V .1.2.13). FastQC V. 0.11.8 werd aanvankelijk gebruikt voor kwaliteitscontrole van ruwe sequentiegegevens. Adapters werden bijgesneden met behulp van AdapterRemoval V. 2.3.1, met leest minder dan 25 bp ook verwijderd. Reads werden vervolgens in kaart gebracht aan referentiesequenties met behulp van BWA , ook het toepassen van mapDamage2.,0 voor de kwantificering van de basisdegradatie, waarbij alignments met referentiesequenties worden geproduceerd. ANGSD werd vervolgens gebruikt om sequenties in FASTA-formaat te produceren.
onzekerheid rond de oorsprong en de biologische mechanismen voor de productie van ambergris heeft ons ertoe gebracht om meerdere mogelijke kandidaat-walvisachtigen en gevleugelde soorten in sequentieanalyse te overwegen. Soortidentiteit werd afgeleid door het in kaart brengen van succes en fylogenetische relatie met 19 walvisachtigen en gevleugelde kandidaat-soorten in NCBI RefSeq (zie het elektronische aanvullende materiaal)., Deze soorten werden geselecteerd op basis van mogelijke geschiktheid als diepduikende zeezoogdieren die een vergelijkbare ecologische niche vullen als potvissen, om uit te sluiten dat dergelijke soorten co-aangepast zijn om ambergris te produceren. De opeenvolgingen van de steekproef werden samengevoegd en uitgelijnd gebruikend MAFFFT v. 7.392 . Fylogenetische boommodellen werden vervolgens geproduceerd in MEGA X met behulp van de maximale waarschijnlijkheid methode met het Hasegawa-Kishino–Yano model , met afstanden geschat door de maximale samengestelde waarschijnlijkheid benadering (details van alle gebruikte referentie sequenties zijn opgenomen in het elektronische aanvullende materiaal).,
resultaten
de fylogenetische analyses ondersteunden ondubbelzinnig de oorsprong van de vier ambergrismonsters (figuur 2; elektronisch aanvullend materiaal, figuur S1). Evenzo, uitlijning met de physeter macrocephalus mitochondrial referentie genoom van NCBI (NC_002503.2) produceerde de hoogste dekkingsresultaten voor alle monsters van alle uitlijningen gemaakt en biedt een zekere attributie, hoewel met significante variaties in succes tussen monsters. Sequencing van het monster van een gestrande potvis (TEXEL151212) met veruit de hoogste dekking (CA., 20×) voor potvis mitochondrion, terwijl een van de jetsam monsters van Pitt Island (S. 01) leverde slechts ongeveer 0,2× dekking (zie Tabel 2). Uitlijningen met kogia sima (dwerg potvis) en Kogia breviceps (pygmee potvis) referentie mitochondriale genomen (NC_041303.1, NC_005272.1) leverden ook dekking (details in elektronisch aanvullend materiaal), hoewel veel sterk behouden functionele gebieden worden gedeeld tussen geanalyseerde soorten, wat resulteert in een hoge sequentie gelijkenis . Echter, de dekking voor kogiid soorten was meestal ongeveer een factor 10 minder dan voor Physeter., De uitlijning met het gehele nucleaire verwijzingsgenoom van P. macrocephalus (asm283717v2) was ook succesvol, hoewel dit duidelijker in vergelijkingen van totaal aantal reads aan het genoom in kaart wordt gebracht. Alignment voor Architeuthis dux( reuzeninktvis), een bekende gemeenschappelijke prooi van potvissen (b .v.), was niet succesvol, maar dit is niet hun overheersende prooi.
Figuur 2. Maximaal-waarschijnlijkheid fylogenetisch boommodel gegenereerd uit referentiesequenties en uitgelijnde Monster mitochondriale genomen., De monsters zijn duidelijk gegroepeerd met potvis (P. macrocephalus) in plaats van dwergachtige en pygmee potvissen (Kogia spp.). Deze boom geeft het hoogste log-waarschijnlijkheidsmodel weer, waarden geven het percentage bomen weer waarin de bijbehorende taxa zijn geclusterd, wat vertrouwen in positionering aangeeft, en taklengtes meten het aantal substituties op elke locatie (zie schaal). Figuur geproduceerd in MEGA X . Walvisafbeeldingen uit: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Een fylogenetische boom met alle 19 kandidaat-soorten wordt gepresenteerd in elektronisch aanvullend materiaal, figuur S1.
de Resultaten van MapDamage tonen opvallend weinig inter-sample variatie van invloed zijn C T overgangen op de 5′ strand eindigt, hoewel een hoger percentage van de G overgangen aan het 3′ uiteinde bestaat voor S. 01 (details in elektronische aanvullend materiaal figuur S2), mogelijke hogere biomoleculaire degradatie., In het algemeen heeft zich echter weinig chemische modificatie voorgedaan en blijft de verdeling van de veranderingen over de strengen uniform en vlak.
discussie
Deze studie heeft aangetoond dat drie jetsam ambergris monsters met vertrouwen kunnen worden toegeschreven aan potvis door middel van DNA-extractie. Hoewel de bevestiging van de oorsprong van een potvis voor jetsam ambergris geen verrassend resultaat is, is deze studie de eerste in het leveren van een significant bewijs-of-concept voor het ophalen van endogeen DNA uit ambergris en het succesvol gebruiken voor de identificatie van organismen., Belangrijk is dat de oorsprong van alle drie jetsam ambergris monsters hier bestudeerd kan worden geïdentificeerd als potvis op basis van niet alleen genetische uitlijning succes, maar ook het modelleren van mitochondriale genomen in fylogenetische verwantschap bomen, waaronder voor een grote steekproef van buitengroep zeezoogdier taxa., Hoewel alle hier geanalyseerde monsters zijn geïdentificeerd als afkomstig van potvis, is het nog steeds heel goed mogelijk dat andere nauw verwante diepduikende zeezoogdieren (zoals de Dwerg en pygmee potvissen) ambergris produceren en tot op heden nog steeds niet zijn geregistreerd.
de belangrijkste oorzaak van de dramatische variatie in genetische dekking tussen monsters is onduidelijk. Analyse van DNA degradatie in kaartschade2.,0 toont weinig correlatie met alignment coverages, zoals te verwachten is, en er is ook weinig variatie tussen ambrein inhoud in monsters die naar verwachting bijdragen aan differentiële DNA conservering. De precieze leeftijd van de huidige jetsam monsters is onbekend, hoewel eerdere studies met succes hebben radiokoolstof gedateerd andere ambergris monsters . Koolstofdatering van relatief recente monsters is echter problematisch vanwege de impact van de uitstoot van fossiele brandstoffen , en koolstofdatering sinds de toename van de antropische koolstofafgifte is onbetrouwbaar., Het produceren van een consistente degradatiesnelheid voor G naar A-overgangen in betrouwbaar gedateerde oudere monsters zou in de toekomst kunnen bijdragen tot een beter begrip van differentiële DNA-schade. Een andere optie voor toekomstig onderzoek zou studies van glutaminedeamidatie en asparaginezuur racemization van analyse van organische peptides kunnen zijn mogelijk ook huidig in ambergris . Alternatief, echter, intra-sample variatie in DNA en ambrein concentratie kan net zo waarschijnlijk verantwoordelijk zijn voor de lage dekking in Monster S.,01, terwijl meer recente blootstelling aan potvisweefsel ongetwijfeld verantwoordelijk is voor de hoge dekking in gestrande walvissteekproef TEXEL151212.
het conserveringspotentieel van ambrein precipitaten voor DNA strekt zich niet alleen uit tot endogene walvisgenetica, maar ook tot metagenomische dekking van het darmmicrobioom van de walvis, en mogelijk ook het DNA van hun prooi. Bijvoorbeeld, kan DNA ook binnen gedeeltelijk of onverteerde pijlinktsnavels blijven die in de feces van potvis worden gevonden, en in ambergris, die zelfs om een pathologische oorzaak van de afscheiding van ambergris worden getheoretiseerd ., Het begrip van de prokaryotic samenstelling van het microbioommilieu in ambergris zou ook verder de oorsprong van ambergris, in het bijzonder in de omzetting van squalene in ambrein en het proces kunnen ophelderen waardoor ambergris in lagen van accretion schijnt te vormen. Verdere analyses van endogene DNA-terugwinning uit jetsam ambergris, waaronder ook DNA uit walvisgut microbiota en prooien, zouden significant meer inzicht in potvis Ecologie, Evolutie en metabolisme opleveren.,
conclusie
Jetsam ambergris is al sinds de achttiende eeuw een raadselachtig materiaal dat in wetenschappelijke publicaties wordt besproken en geanalyseerd . Deze studie is de eerste tot onze kennis om definitieve bevestiging van de biologische oorsprong van jetsam ambergris monsters presenteren als potvissen, door middel van DNA-analyse. Daarnaast wordt in dit onderzoek echter het potentieel van ambergris als nieuwe bron van genetische gegevens met betrekking tot potvissen met een aanzienlijke levensduur in de loop van de tijd uiteengezet., Er moet nog meer opheldering worden verkregen door de studie van de conserverende condities van DNA in ambrein en van de differentiële effecten van meerdere factoren. De mogelijke implicaties voor het helpen van ons begrip van de populatiedynamiek in het verleden bij walvissen en hun ecologisch geassocieerde taxa kunnen echter diepgaand zijn. De oudst bekende ambergri ‘ s in Pleistoceen zijn voorzien van permineraliseerde pijlinktsnavels die aminozuren bevatten die endogeen zijn voor pijlinktvissen, die de auteurs toeschrijven aan de conserverende capaciteit van het lokale sediment ., Hoewel het onwaarschijnlijk is dat DNA bewaard blijft voor een dergelijke leeftijd (1,75 Ma), kan deze bevinding ook worden toegeschreven aan de werkzaamheid van ambergris en ambrein als conserveermiddel substraten. Er is nog veel onbekend over de ecologie en de aanpassing van de zeereuzen die vroeger gekarakteriseerd werden als semi-mythische beesten, en ambergris kan nu een kleine maar belangrijke sleutel blijken te zijn om een aantal verdere aspecten van hen te begrijpen.
ethiek
alle monsters werden verkregen en ethisch geanalyseerd in deze studie, onderdeel van het DNRF-128 PROTEIOS project., Van de vier ambergrismonsters die in deze studie werden geanalyseerd, werden er drie (S. 01–S. 03) gesubstampt uit materiaal dat S. J. R. in eerdere publicaties (zie hierboven) heeft bestudeerd, verkregen als jetsam ambergris die op stranden is gevonden (steekproef nrs. ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 en ACL237-S. 03). Het vierde Monster (TEXEL151212) werd door Dr.A. Oosterbaan namens het Ecomare Museum, Texel, Nederland, ter beschikking gesteld als deelmonster van het ambergris specimen TEXEL151212. We zijn dankbaar voor de toestemming van het museum om dit monster te gebruiken.,
toegankelijkheid van gegevens
bijdragen van auteurs
concurrerende belangen
We verklaren dat we geen concurrerende belangen hebben.
financiering
financiering werd verstrekt door de Deense nationale Onderzoeksstichting grant PROTEIOS (DNRF128).
Dankbetuigingen
R. M. is Dr. J. A. Samaniego dankbaar voor advies over genomische analyses, en ook voor advies en discussies aan M. McCarthy. Wij danken dr. A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) voor sample S. 04 en anonieme verzamelaars voor sample S. 01–S. 03., De auteurs willen graag de hulp van het Deense Nationale High-Throughput Sequencing Centre in Illumina data generation erkennen.
voetnoten
elektronisch aanvullend materiaal is online beschikbaar op https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
gepubliceerd door de Royal Society onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, die onbeperkt gebruik toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.