te identificeren de aarde is de thuisbasis van miljoenen bacteriesoorten, elk met unieke kenmerken. Het identificeren van deze soorten is van cruciaal belang bij de evaluatie van milieumonsters. Artsen moeten ook verschillende bacteriesoorten onderscheiden om geïnfecteerde patiënten te diagnosticeren.
om bacteriën te identificeren, kunnen verschillende technieken worden gebruikt, waaronder microscopische observatie van morfologie of groei op een specifiek medium om de morfologie van de kolonie te observeren., Genetische analyse, een andere techniek voor het identificeren van bacteriën is gegroeid in populariteit in de afgelopen jaren, gedeeltelijk toe te schrijven aan 16S ribosomal het gen rangschikken van RNA.
het bacteriële ribosoom is een eiwit-RNA-complex dat bestaat uit twee subeenheden. De 30S-subeenheid, de kleinere van deze twee subeenheden, bevat 16S rRNA, die door het 16S rRNA-gen wordt gecodeerd dat binnen genomic DNA wordt bevat. De specifieke gebieden van 16S rRNA zijn hoogst behouden, wegens hun essentiële functie in ribosoomassemblage. Terwijl andere gebieden, minder kritisch om te functioneren, tussen bacteriële species kunnen variëren., De variabele gebieden in 16S rRNA, kunnen dienen als unieke moleculaire vingerafdrukken voor bacteriële species, waardoor we fenotypisch identieke stammen kunnen onderscheiden.
na het verkrijgen van een kwaliteitsmonster van gDNA kan PCR van het 16S rRNA-coderingsgen beginnen. PCR is een algemeen gebruikte moleculaire biologiemethode, die uit cycli van denaturatie van het double-stranded malplaatje van DNA bestaat, het ontharden van universele inleidingsparen, die hoogst behouden gebieden van het gen, en de uitbreiding van inleidingen door de polymerase van DNA versterken., Terwijl sommige primers het grootste deel van het 16S rRNA coderen gen versterken, versterken anderen slechts fragmenten van het. Na PCR, kunnen de producten via agarose-gelelektroforese worden geanalyseerd. Als de versterking succesvol was, zou de gel één band van een verwachte grootte moeten bevatten, afhankelijk van het gebruikte primerpaar, tot 1500bp, de geschatte lengte van het 16S rRNA-gen.
Na zuivering en sequencing kunnen de verkregen sequenties vervolgens worden ingevoerd in de BLAST-database, waar ze kunnen worden vergeleken met referentie 16S rRNA-sequenties., Aangezien deze database overeenkomsten retourneert op basis van de hoogste gelijkenis, maakt dit bevestiging van de identiteit van de bacterie van belang. In deze video observeert u 16S rRNA gen sequencing, inclusief PCR, DNA sequentie analyse en editing, sequentie assemblage en database searching.
bij het hanteren van micro-organismen is het van essentieel belang goede microbiologische praktijken te volgen, waaronder het gebruik van aseptische technieken en het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Na het uitvoeren van een passende risicobeoordeling voor het betrokken micro-organisme of milieumonster, een testcultuur verkrijgen., In dit voorbeeld wordt een zuivere cultuur van Bacillus subtilis gebruikt.
om te beginnen, Kweek uw micro-organisme op een geschikt medium onder de juiste omstandigheden. In dit voorbeeld wordt Bacillus subtilis 168 ‘ s nachts gekweekt in lb-bouillon in een trillende incubator die is ingesteld op 200 rpm bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een in de handel verkrijgbare kit om genomisch DNA of gDNA te isoleren van 1,5 milliliter van de NACHTCULTUUR van B. subtilis.
om de kwaliteit van het geïsoleerde DNA te controleren, meng eerst vijf microliter van de geïsoleerde gDNA met één microliter DNA-gelladingskleurstof. Plaats vervolgens het monster op een 0.,8% agarose gel, met DNA-kleuring reagens, zoals SYBR safe of EtBr. Na dit, laad een één kilobase moleculaire massa standaard op het gel, en loop de elektroforese tot de voorste kleurstof is ongeveer 0,5 centimeter van de bodem van het gel. Zodra de gelelektroforese is voltooid, visualiseer de gel op een blauw licht transilluminator. De gDNA moet verschijnen als een dikke band, boven 10 kilobase in grootte en hebben minimale smering.
hierna, om seriële verdunningen van de gDNA te maken, labelen drie microcentrifugebuizen als 10X, 100X, en 1000X., Gebruik vervolgens een pipet om 90 microliter steriel gedestilleerd water in elk van de buisjes te doseren. Voeg vervolgens 10 microliters van de gDNA-oplossing toe aan de 10x-buis. Pipetteer het hele volume op en neer om ervoor te zorgen dat de oplossing grondig wordt gemengd. Verwijder vervolgens 10 microliters van de oplossing uit de 10x tube en breng deze over in de 100x tube. Meng de oplossing zoals eerder beschreven. Breng ten slotte 10 microliters van de oplossing over in de 100x buis, naar de 1000x buis.
om het PCR-protocol te starten, ontdooi de benodigde reagentia op ijs. Bereid dan de PCR-hoofdmix voor., Aangezien de polymerase van DNA bij kamertemperatuur actief is, moet de reactieopstelling op ijs voorkomen. Aliquot 49 microliters van de master mengen in elk van de PCR buizen. Voeg dan één microliter van template aan elk van de experimentele buizen en één microliter van steriel water aan de negatieve controlebuis toe, pipetteren op en neer om te mengen. Stel hierna de PCR-machine in volgens het programma dat in de tabel wordt beschreven. Plaats de buizen in de thermocycler en start het programma.,
zodra het programma is voltooid, onderzoek de kwaliteit van uw product via agarose gelelektroforese, zoals eerder aangetoond. Een succesvolle reactie met behulp van het beschreven protocol moet een enkele band van ongeveer 1,5 kilobase opleveren. In dit voorbeeld leverde het monster met 100x verdunde gDNA het hoogste kwaliteitsproduct op. Vervolgens zuivert u het beste PCR-product, in dit geval de 100X gDNA, met een in de handel verkrijgbare kit. Nu kan het PCR-product voor het rangschikken worden verzonden.
in dit voorbeeld wordt het PCR-product gesequenced met behulp van vooruit-en omgekeerde primers., Aldus, worden twee gegevensreeksen, die elk een opeenvolging van DNA en een chromatogram van DNA bevatten, geproduceerd: één voor de voorwaartse inleiding en de andere voor de omgekeerde inleiding. Onderzoek eerst de chromatogrammen die van elke inleiding worden gegenereerd. Een ideaal chromatogram zou gelijkmatig uit elkaar geplaatste pieken met weinig tot geen achtergrondsignalen moeten hebben.
als de chromatogrammen dubbele pieken vertonen, kunnen meerdere DNA-sjablonen aanwezig zijn geweest in de PCR-producten en moet de sequentie worden weggegooid. Als de chromatogrammen pieken van verschillende kleuren in dezelfde plaats bevatten, heeft de rangschikkende software waarschijnlijk nucleotiden verkeerd genoemd., Deze fout kan handmatig worden geïdentificeerd en gecorrigeerd in het tekstbestand. De aanwezigheid van brede pieken in het chromatogram wijst op een verlies van resolutie, die miscounting van de nucleotiden in de geassocieerde gebieden veroorzaakt. Deze fout is moeilijk te corrigeren en mismatches in een van de volgende stappen moeten worden behandeld als onbetrouwbaar. De slechte kwaliteit van de chromatogramlezing, die door de aanwezigheid van veelvoudige pieken wordt vermeld, komt gewoonlijk bij de eerste vijf en eerste drie einden van de opeenvolging voor. Sommige sequencing programma ‘ s verwijderen deze lage kwaliteit secties automatisch., Als uw reeks niet automatisch werd afgekapt, identificeer de fragmenten van lage kwaliteit en verwijder hun respectieve bases uit het tekstbestand.
gebruik een DNA-assemblageprogramma om de twee primersequenties in één continue sequentie te monteren. Vergeet niet, sequenties verkregen met behulp van forward en reverse primers moeten gedeeltelijk overlappen. In het assemblageprogramma van DNA, voegt de twee opeenvolgingen in FASTA-formaat in de aangewezen doos toe. Klik vervolgens op de knop Verzenden en wacht tot het programma de resultaten retourneert.
om de samengestelde reeks te bekijken, klikt u op Contigs in het tabblad resultaten., Selecteer vervolgens montagedetails om de details van de uitlijning te bekijken. Navigeer naar de website voor de basic local alignment search tool, of BLAST, en selecteer de nucleotide BLAST tool om uw sequentie te vergelijken met de database. Voer uw sequentie in het tekstvak query sequence in en selecteer de juiste database in het scroll naar beneden menu. Klik ten slotte op de BLAST-knop onderaan de pagina en wacht tot de tool de meest vergelijkbare sequenties uit de database retourneert.
in dit voorbeeld is de top hit B., subtilis stam 168, toont 100% identiteit met de sequentie in de ONTPLOFFINGSDATABASE. Als de top hit niet 100% identiteit aan uw verwachte soort of stam toont, klikt u op de volgorde die het meest overeenkomt met uw zoekopdracht om de details van de uitlijning te zien. Uitgelijnde nucleotiden zullen worden samengevoegd door korte verticale lijnen en mismatched nucleotiden zullen hiaten tussen hen hebben. Focus op de geïdentificeerde niet-overeenkomende regio ‘ s, herzie de sequentie en herhaal de BLAST search indien gewenst.