Figur 1. Tre Utvalgte bilder fra en film av POLO-tomme celler viser klart at det over tid, intens centromere/kinetochore signal (rødt) løser inn et par punkter, som viser at kromosomene er syntelically knyttet til spindel mikrotubuli (grønn). 4D fluorescens mikroskopi datasett ble samlet inn for hver 30 sekunder med 0.,5 mm z-trinn som dekker hele celle volum ved hjelp av en 100°, 1.4 NA plan-apochromatic mål ved 25°C med Andor Revolusjon roterende disk konfokal enhet og iXon EMCCD kameraet, begge drevet av Andor IQ live cell imaging software.

Mitotic celledeling, er avhengig av evnen til celler til riktig distribuere søster kromatidene i forming celler. Pålitelig utføre funksjonen som cellene bruker internt redigering mekanismer for å korrigere kromosom / spindel fiber vedlegg., Sammenkoblede kinetochores er vanligvis justeres til riktig feste spindel fibre og skiller chromatin, men feilaktige og feiljustert kinetochores gjøre resultat. Celler inneholder spesialiserte redigering mekanismer for å forebygge og korrigere disse forskjøvet kinetochore par, selv om den eksakte mekanismen er ikke godt forstått 1,2 ., Det er postulert av Tatiana Moutinho-Santos ved Universidade do Porto, Portugal Instituto de Biologia Molekylær e Celular (IBMC) at tilstedeværelsen av POLO kinase er nødvendig for å fremme kromosom bi-orientering (betegnet amphitelic ordning) og dermed bevare den riktige kinetochore justering.

for Å bedre forstå sin rolle i regulering av kinetochore utvikling, Dr. Moutinho dos Santos studert utarmet Drosophila POLO kinase i levende celler for å underbygge POLO engasjement i redigering funksjoner som kreves for å opprettholde amphitelic kinetochore arrangement., I dette tilfellet, syntelic arrangement (søster kinetochores knyttet til mikrotubuli som kommer fra samme spindel) ble studert. Timelapse analyse av cellesyklus ble utført på Drosophila S2 celler stabilt uttrykke CID-mCherry for visualisering av centromeres, og GFP-en-tubulin til mikrotubuli. Visualisering av kinetochores er krevende på grunn av sin lille størrelse, lav fluorescerende signal og kort opptreden under celledeling. Konfokal fluorescens mikroskopi brukes ofte til bilde kinetochores, men selv i dette miljøet, visualisering er fortsatt vanskelig., Den kinetochores er veldig små (300 nm)3, i nærheten av den laterale å løse evner av lys mikroskop, og overstiger mikroskopet aksial evne til å løse. Videre, bildebehandling fluoriserende markører i levende celler utgjør potensielle phototoxic og photobleaching effekter. Intens laser belysning kan skape phototoxicity problemer, spesielt skadelig for levende, dele celler.

Andor Revolusjon XD roterende disk konfokal mikroskopi er ansatt for å overvinne Dr. Moutinho dos Santos unik utfordring knyttet til observasjon av kinetochores., I dette tilfellet, fire separate faktorer som må være samtidig adressert til tilstrekkelig visualisere dynamisk cellulære prosesser som:

  • Hurtigvalg av oppkjøpet
  • Romlig og temporal å løse evne
  • evne til å oppdage svært lav fluorescens intensitet nivå
  • Håndtering av tilgjengelig fluorescens signal

Disse temaene romlig, temporal og intensitet oppløsning gjentas ofte med fluorescens mikroskopi og er ofte på kant med eksperimenter som involverer observasjon av celleviabilitet., For eksempel, lange eksponeringer med kameraet og lengre perioder med høy intensitet belysning generere phototoxic effekter som kan skade eller ødelegge levende celler. Samtidig, så vidt merket microstructures etterspørsel lengre eksponering til å visualisere, men kan bli negativt påvirket av photobleaching. Compounding problemet er behovet for å kombinere tradisjonell tre-dimensjonale data med en gang. Til slutt, det er fortsatt nødvendig for å skille signal fra støy og outof – fokus dis.

Hurtigvalg av oppkjøpet er av særlig betydning for Dr. Mountinho dos Santos., Kontroll S2 celler som viser en divisjon syklus på ca 30 minutter. Imidlertid, POLO utarmet S2 celler som er benyttet i hennes eksperimenter viste en arrestert perioden i overkant av åtte timer. Opptak POLO utarmet celledeling krever samling av mellom 7,200 og 12.000 bilde angir (to fluorochromes avbildes hver tretti sekunder for én til fem timer, kjøpt på 0,5 micron aksial skritt på opp til 20 trinn for aksial kinetochore oppløsning)., Konvensjonelle fluorescens mikroskopi og laser belysning vil tillate verken skånsom belysning krav er nødvendig eller hastigheten på kjøp for å fullføre denne tid-sensitive oppgave. For eksempel laser rastering i tradisjonell konfokal mikroskopi krever lengre tidsperioder tid til å samle signal fra prøven. Roterende disk konfokal-systemer brukes til å overvinne disse tradisjonelle barrierer, og til å avsløre ny innsikt i molekylære kinetochore redigering teknikker.,

i Forhold til konvensjonelle widefield fluorescens-systemer, og den romlige oppløsningen på en roterende disk konfokal er overlegen i både sideveis (x og y) og aksial (z) mål. Gjennom konstant skanning av hullet utvalg, prøver kan vises i sanntid på høy kontrast, gir klare bilder på diffraksjon grensene av mikroskopet optikk. Dette gjør at 3D-visualisering og forståelse av de dynamiske kinetochore atferd i forhold til mikrotubuli av spindel., Kinetochore og centromere lateral oppløsning av 300nm og spindel fiber oppløsning på 300-500 nm ble rapportert, og er beskrevet i detalj i Figur A.

Intensitet Oppløsning
Visualisere fluoriserende fargestoff kinetochores forbundet med hver centromere steder ytterligere krav på kjøp-systemet. Den centromeres og kinetochores under studien er først og fremst synlig bare under celledeling interphase. Som cellene passerer gjennom på profase for, den centromeres har allerede løst seg inn i Drosophila er typisk tolv kromosom par., Administrerende det lyset som er tilgjengelig budsjett under lengre oppkjøpet forutsetter skånsom belysning og høy oppløsning i stand ved å spinne disk teknikker. Åpningene i den roterende platen enhet gir disse fordelene. Fordi lys interesserer fluorophores bare når en blenderåpning er til stede, phototoxic effektene er minimale. Mens counterintuitive, en redusert lys budsjett betyr ikke at det er svak, er vanskelig å oppdage ting. Intensitet oppløsningen er økt gjennom den roterende platen er utelukkelse av ute av fokus signal og påfølgende signal amplifisering av en EMCCD kameraet arkitektur., Dette skaper en ny mulighet til å generere høyere kontrast bilder avslører utvikling og justering av punctate objekter som kinetochores.

Konklusjon
bruk av roterende disk teknologi i Dr. Mountinho dos Santos levende celle-programmet førte til en viktig observasjon. I fravær av POLO kinase, Drosophila celler ble vist til mangel korrigerende mekanismer som er nødvendig for å opprettholde amphitelic kromosom arrangement., Tilstedeværelsen av POLO ble vist å gi det rette miljøet for riktig centromere arkitektur, samtidig som du sikrer forsvarlig kromosom bi-orientering. Kultivert Drosophila celler under mitosen i fravær av POLO kinase kromosomer legge til spindel fibre med syntelic retning, dvs., med søster kinetochores knyttet til mikrotubuli som kommer fra en enkelt spindel polet.

Denne konklusjonen ble trukket av en grundig analyse av 4D fluorescens mikroskopi i celler som uttrykker fluoriserende fargestoff centromere/ kinetochore markør og mikrotubuli. (Figur 1).