Observasjon
Mye av den fremgangen i mikrobiologi har stole på studiet av «rene kulturer.»Dette er kulturer som bare inneholder én type celle, gjerne med kultur avledet fra en innledende enkelt celle., Fra den tidlige utviklingen av metoder for å etablere rene kulturer (1), det har vært mange eksempler i hvilke kulturer som opprinnelig ble ansett å være ren ble senere funnet å inneholde to typer mikrober. I noen tilfeller, disse utilsiktede multispecies kulturer har ført til viktige gjennombrudd, for eksempel oppdagelsen av interspecies hydrogen overføring (2). Imidlertid, med bruk av dype sekvensering teknologier, kan det med rimelighet kan forutses at uoppdaget forurensninger i kulturer ville ikke lenger være en betydelig bekymring.,
Geobacter sulfurreducens belastning PCA ble isolert i midten av 1990-tallet ved hjelp av standard berikelse og isolasjon teknikker som inkluderte fortynning til utryddelse i flytende medium, fulgt av gjentatte striper av isolerte kolonier på agar-stivnet middels (3). Dette er den klassiske strategi undervist i de mest populære innledende mikrobiologi lærebøker (4-6). Senere, G. sulfurreducens belastning DL1 ble innhentet av ekstra restreaking av isolert PCA kolonier (7). Med utviklingen av metoder for genetisk manipulering av G. sulfurreducens (7) og sekvensering av dens genom (8), G., sulfurreducens ble Geobacter arter av valget for å studere fysiologi og roman ekstracellulære electron overføre egenskapene til denne miljømessig viktig slekten (9). Første sekvensering av 16S rRNA-genet i kulturen (3), samt sekvensering av genom første til 8-brett (8) og deretter til 80-brett (10, 11) dekning, indikerte at den kulturen som finnes bare en belastning.,
I et forsøk på å adaptivt utvikle seg DL1 til å produsere mer strøm, det var inokulert i en bioelektrisk system med en grafitt-anode klar på en potensiell (-400 mV versus Ag/AgCl) anses å være nær den nedre grensen på som nåværende generasjon fra acetate ville være mulig (12). En isolere innhentet fra anoden biofilm, utpekt G., sulfurreducens belastning KN400 (12), er bedre inokulat belastning i å produsere elektrisk strøm, og dette overlegenhet er tillagt minst delvis til sin evne til å produsere mer «mikrobiell nanotråder,» elektrisk ledende protein filamenter som viser metallic-som elektrisk ledningsevne (13, 14).
Det ble først antatt at belastningen KN400 hadde samlet en eller flere mutasjoner som forbedret sin kapasitet for ekstracellulære electron overføring., Dette vil være analogt til utvalget for mutant stammer under adaptiv evolusjon av belastning DL1 for electron utveksling med andre organismer (11) eller en høyere forekomst av Fe(III) oksid reduksjon (10). Imidlertid, komparativ genomics åpenbart at genom sekvens av belastning KN400 inneholdt mer enn 27,270 enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) (15). En tredjedel av de genene som hadde minst ett nukleotid polymorphism, og en fjerdedel hadde en polymorphism som påvirket som følge protein sekvens (15). Basert på typiske mutasjon priser på 6.,3 × 10-9/bp per generasjon (16), ville det ta mer enn 1000 år å samle så mange mutasjoner i belastning DL1. Videre er det ingen orthologs i DL1 belastning for 139 av åpne lesing rammer (ORFs) i KN400 belastning genom, de fleste som er nært knyttet til gener i phylogenetically ulike organismer (15).
Disse hensynene og det faktum at ORFs unik for KN400 ikke ble oppdaget når inokulat kultur var resequenced (10, 11) førte til hypotesen om at KN400 angitt bioelectrochemical systemet som en forurensning., For å vurdere denne muligheten, renhet DL1 kultur ble videre vurdert med enda høyere følsomhet.
Begge DL1 og KN400 inneholder omcS, et gen for en ytre overflate cytokrom som har en av de høyeste andelene av SNPs (36 SNPs/kb) mellom to stammer (15). Dette genet ble forsterket fra DL1 kultur som hadde blitt brukt til å inoculate den bioelectrochemical system, og PCR-produktene ble sekvensert med Illumina Hi-Seq 2000 (se Tekst-S1 i de supplerende materiale)., Den KN400 sekvensen ble oppdaget, noe som indikerer at KN400 var til stede i den første inokulat brukt til anoden utvalget studie. Imidlertid, av >107 høy kvalitet sekvenser tatt seg opp igjen, bare 286 var KN400 sekvenser versus 1.5 × 107 DL1 sekvenser (Tabell 1).
Tekst S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported lisens som tillater fri ikke-kommersiell bruk, distribusjon og reproduksjon i enhver medium, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert.,
- Vis inline
- Vis popup
Estimater av belastning KN400 overflod i ulike culturesa
Tabell S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.,0 Unported lisens som tillater fri ikke-kommersiell bruk, distribusjon og reproduksjon i enhver medium, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert.
Den relative overflod av KN400 belastning i samme kultur ble videre vurdert av kvantitativ PCR (qPCR) med et primersett som er spesifikke for et gen finnes bare i KN400 (se Tekst S1 og Tabell S1 i de supplerende materiale) og et primersett som oppdaget både KN400 og DL1 (se Tabell S1 i de supplerende materiale)., Den relative overflod av KN400-spesifikke sekvens var lik som den KN400 omcS sekvenser bestemt av sekvensering tilnærming (Tabell 1). Sekvens analyse og qPCR analysen av PCA kultur avsatt på ATCC åpenbarte nærvær av KN400 på en lignende lav overflod (Tabell 1).
Vi prøvde å fjerne den sjeldne KN400 forurensning fra DL1 kultur ved gjentatt restreaking av isolerte kolonier vokst på stivnet acetat-fumarate medium (7), men KN400 belastning fortsatte å holde på en lav frekvens i de isolerte kolonier (Tabell 1)., Imidlertid, en kultur som KN400 kunne ikke lenger bli oppdaget ble innhentet i væske-acetat-fumarate medium (se Tekst-S1 i de supplerende materiale) som høyeste fortynning viser vekst ble utsatt for flere etterfølgende runder av seriell fortynning (Tabell 1). Dette viste at DL1 belastning krever ikke sjelden tilstedeværelse av KN400 for å vokse i acetate-fumarate medium som denne kulturen er rutinemessig vedlikeholdt.
Når ren KN400 og KN400-gratis DL1 kultur ble inokulert i acetate-fumarate medium i like mengder, DL1 outcompeted KN400 (Fig., 1a). Dette er i samsvar med den slutning at når to stammer som var vokst separat, DL1 vokste mye raskere enn KN400 (optisk tetthet på 600 nm på 0,04 for KN400 versus 0.65 for DL1 etter 36 timers inkubering; se Fig. S2 i de supplerende materiale) i samme medium. Andelen av KN400 fortsatte å falle, med påfølgende overføringer (1% inokulat) til overflod av KN400 var sammenlignbar med det som i PCA-og DL1 lager kulturer (se Tekst-S1 i de supplerende materiale). KN400 holdt seg på dette lave nivået med ytterligere overføringer (Fig. 1a).,
Figur S2
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported lisens som tillater fri ikke-kommersiell bruk, distribusjon og reproduksjon i enhver medium, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert.,
Vekst og aktivitet av belastning KN400 under ulike vekstforhold. (a) Relative overflod av KN400 i påfølgende mid-logg overføringer (1% inokulat) av en kultur startet med like andeler av KN400 og DL1. Resultatene er middel og standardavvik av triplikat kulturer. (b) Nåværende produksjon når DL1 kultur ble innført i anoden kammer av en bioelectrochemical system med en grafitt-anode klar på -400 mV versus Ag/AgCl. Den KN400-fri kultur produsert ingen strøm over denne gangen., (c) Relativ overflod av KN400 i anoden biofilm når den første inokulat var DL1 kultur senere funnet å også inneholde KN400. Resultatene er middel og standardavvik av triplikat kulturer.
Gjentatte forsøk på å vokse KN400-gratis DL1 kultur på en anode klar på -400 mV var mislykket. Imidlertid, gjeldende var lett produsert i et annet sett av eksperimenter der DL1 kultur inneholder KN400 fungerte som inokulat (Fig. 1b)., En qPCR analyse av DNA ekstrahert fra anoden biofilm indikert at 100% av den omcS sekvenser ble KN400 innenfor andre transfer (Fig. 1c). Disse resultatene tyder på at grunnen til at KN400 dukket opp på anoder var at DL1 belastning var ikke i stand til å vokse under de vilkårene som stilles. Uten denne uvanlige selektive press, KN400 ville ha forblitt uoppdaget i PCA-og DL1 kulturer selv med tiden tilgjengelig neste generasjons sekvensering metoder som kan teoretisk gi thousandsfold dekning i genom-sekvensering.,
De faktorer som bidrar til den langsiktige, vedvarende belastning KN400 på ekstremt lav frekvens i DL1 kultur er fortsatt et mysterium. Betydningen av fysisk isolere enkeltceller ved metoder som er mer avgjørende enn streker på fast medium for å etablere rene kulturer har blitt anerkjent for noen tid (17), og stadig mer sofistikerte metoder for å oppnå dette fortsette å bli utviklet (18-23)., Imidlertid, plating metoder som har vært i bruk i mer enn 100 år, og er lært opp til hver mikrobiologi student som standard fremgangsmåte for å få rene kulturer (4-6) er fortsatt den mest vanlige. Resultatene som er presentert her viser at uten encellede isolasjon, kryptiske forurensninger kan overleve med svært lav frekvens i kulturer over flere tiårs intensiv etterforskning og kan unngå å bli oppdaget av selv den mest sofistikerte metoder for sekvensering tilgjengelig for øyeblikket.,
Figur S1
Copyright © 2013 Shrestha et al.
Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under vilkårene i Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported lisens som tillater fri ikke-kommersiell bruk, distribusjon og reproduksjon i enhver medium, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert.,