3.1.2.2. HPLC
ved hjelp av HPLC acetonitrile – eller hexane-baserte mobile faser direkte påvisning av fosfolipider uten forutgående opprydding av råolje ekstrakt, og dermed gjøre disse metodene enkel og rask. Men disse metodene ikke effektivt skille de forskjellige inositol fosfolipider. Nakamura et al. (1989) har utviklet en HPLC-prosedyre som er spesielt analyserer PtdIns og PtdInsP2 i hjernen., I denne metoden, som kalles lipid-ekstrakt er første derivatized med 9-anthryldiazomethane å produsere (9-anthryl) PtdInsP og di(9-anthryl) PtdInsP2 og deretter derivatized eksempel er atskilt med HPLC med UV-deteksjon på 245 nm. PtdCho, PtdIns, PtdSer, PtdEtn og SM er ikke derivatized med denne reagensen, og som derfor ikke forstyrre analysen (Yamada et al., 1988). Denne metoden er mer sensitiv enn underivatized UV-deteksjon metode for analyse av inositol fosfolipider.
Lav (1990) har beskrevet bruken av DEAE cellulose kolonner for preparative HPLC av hjernen lipider., Hjernen fosfolipider oppløst i 50 ml av Løsemiddel En (kloroform/metanol/H2O, 20:9:1, ved vol.) og brukt til cellulose kolonne (DEAE cellulose, Sigma), som er vasket med lut og syre til nøytralitet. Vasket DEAE cellulose er pakket inn i et glass kolonne (2 cm × 38 cm) med løsemiddelresistent beslag. Kolonnen er så eluted ved en vannføring på 100 ml/h 1 1 lineært fall fra 100% Løsemiddel En 100% Løsemiddel B (Solvent-En inneholder 0,6 M ammonium acetat) og 13-15 ml fraksjoner er samlet inn og analysert for fosfor (Fig. 3.3).,
Fig. 3.3. Isolering av PtdInsPs fra storfe hjernen av en DEAE-cellulose kolonne kromatografi. Acid vasket metanol-påskyndet Folch Brøkdel var eluted fra en DEAE-cellulose kolonne med en gradient på 100% Løsemiddel En (kloroform/mefhanol/H2O, 20:9:1, ved vol.) 100% Løsemiddel B (Solvent-En inneholder 0,6 M ammonium acetat) og 13-15 ml fraksjoner som samles inn. Fraksjoner ble analysert for organisk fosfor. Gjennomsnittlig utvinning av anvendt organisk fosfor var ca 90%., Peak-eluting på brøk nummer. Twenty-fem var reproduserbarhet til stede, men ble ikke identifisert. Sammensetningen av toppene ble bestemt ved TLC analyse av sammensatte fraksjoner. Toppene er identifisert som vist i figuren.
Gjengitt fra Lave (1990) med tillatelse fra utgiver.
Alternativt, Lav (1990) utført kromatografiske trinn ved preparative HPLC ved hjelp av en amino-kolonnen. Hjernen fosfolipider ble oppløst i 5 ml av Løsemiddel En og ble brukt på en strømningshastighet på 2.,5 ml/min 10 mm x 250 mm amino-NP kolonne (5 mikrometer sfærisk silica med n-propylamine binded fase, IBM Instrumenter, Danbury, CT) med en 4,5 mm x 50 mm vakt kolonne likevekt med Løsemiddel A. kolonnen er eluted ved en vannføring på 2,5 ml/min med 25 ml av Løsemiddel En, en 125 ml gradient av 100% Løsemiddel En 100% Løsemiddel B, og 100 ml 100% Løsemiddel B; 5 ml fraksjoner som blir samlet inn. Den sammenslåtte fraksjoner er konsentrert ved å justere til 18 ml med Løsemiddel En og fosfolipider som er trukket ut. Gjennomsnittlig utvinning av organisk fosfor er 80%., En fullstendig atskillelse av PtdIns (90 ml), PtdInsP (150 ml) og PtdInsP2 (160-200 ml) ble innhentet for (chromatogram ikke vist). Den PtdIns, men overlapper med PtdSer. Sammensetningen av toppene ble bestemt med TLC av sammensatte fraksjoner.
Lav (1990) har også beskrevet en HPLC-rensing av -merket PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 fra humane blodplater. Lipid utdrag fra blodplater ble utarbeidet fra 60 ml frisk menneskelig blod i nærvær av metanol påskyndet storfe hjernen PtdInsPs som en transportør, er endelig redissolved i 0.,5 1 av Løsemiddel En og anvendt på en strømningshastighet på 1 ml/min til en 4,5 mm × 250 mm amino-NP-kolonnen likevekt i Løsemiddel A. kolonnen er eluted med 5 ml av Løsemiddel En (25 ml lineært fall fra 100% Løsemiddel En 100% Løsemiddel B) og 20 ml av Løsemiddel B. En milliliter fraksjoner er samlet inn og radioaktivitet bestemt av væske scintillasjon telle. Gjennomsnittlig gjenvinning av brukt radioaktivitet er ca 70%. Det er en utmerket oppløsning av tre inositol phosphatides men PtdIns overlapper med PtdOH., Derfor er dette HPLC-prosedyren er ikke egnet for utarbeidelse av PtdIns siden PtdOH, som i de fleste celletyper er mer raskt merket av Pi, er ikke løst fra det. Det er sannsynlig at andre anioniske fosfolipider som PtdSer vil være dårlig løst fra PtdIns av amino-NP kolonne, som observert med DEAE-cellulose prosedyre.
Som nevnt ovenfor, ingen av de nevnte metodene er effektive i å skille de enkelte PtdInsPs i ren form fra råolje vev ekstrakter. Derfor kalles lipid-ekstrakter må behandles av flere kromatografiske trinn., For dette formål, ekstrakt er først utsatt til Sephadex kromatografi for separasjon av lipider fra nonlipids i utdraget. Lipid brøkdel helles deretter over på en DEAE kolonne som er eluted med forskjellige løsemidler. Den PtdInsPs er gjenopprettet av elution med kloroform/metanol/ammonium salt som de siste elution trinn. Den enkelte fraksjoner er konsentrert til 100 µl på 45°C under nitrogen og deretter konsentrert rester er videre skilt med kassett-kolonne-kromatografi, TLC, HPLC eller andre kromatografiske prosedyrer.,
Singh (1992) har beskrevet ekstraksjon og analyse av PtdIns, PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 ved hjelp av en Sep-Pak tonerkassetten. Totalt lipid ekstrakt (Folch et al., 1957) av rat brain synaptosomes og microvessels ble først utarbeidet og den første brøkdel generert (Del 1) ble samlet inn og videre ut til separat fosfolipider og glycolipids som beskrevet av Dugan et al. (1986). Phospholipid brøkdel ble utsatt for DEAE-cellulose kromatografi (separasjon sekvens 4) som beskrevet av Rouser et al. (1969) for å rense videre inositol lipider., Det rensede ekstraktet ble overført til en Sep-Pak tonerkassetten. Ulike inositol lipider er eluted fra kolonnen med en lineær gradient av ammonium acetat og vann fra 0,5% av ammonium acetat (200 mM) og 99.5% av vann til 75% av ammonium acetat og 25% av vann i 60 min ved en vannføring på 0,5 ml/min (se Kapittel 2). Kolonnen eluate for 120 min var samlet i 1 ml fraksjoner. Ulike topper ble identifisert ved hjelp av PtdIns, PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 topper som referansepunkter., Fraksjoner som inneholder enkelte inositol lipider ble samlet og analysert ved HPLC som beskrevet av Geurts van Kessel et al. (1977). Enkelte fosfolipider ble oppdaget på 206 nm ved hjelp av en diode array detektor programmert til å skanne en 200-350 nm. Singh (1992) har vist 50-90% utvinning av PtdIns og InsPs fra hjernen prøver. InsP3 og InsP4 utstilt laveste recovery grunn av dårlig kvantifisering snarere enn en dårlig utvinning metode. Kassetten metoder har ikke blitt brukt til isolering av PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 og PtdIns (3,4,5)P3.
Cronholm et al., (1992) har beskrevet isolasjon av PtdInsPs fra rat bukspyttkjertel. Hver bukspyttkjertel ble umiddelbart homogeniserte i 3 ml kloroform/metanol (1:2, v/v), og ca 3 MBq av 3H-merket PtdIns(4)P eller PtdIns(4,5)P2 ble lagt sammen med 0,6 ml 1.2 aq. HCl før ekstraksjon med kloroform, som beskrevet av Schacht (1981). Metanol ble lagt til den sammenslåtte og vasket ekstrakter for å gi kloroform/metanol (3:2, v/v). Løsningen ble brukt til Lipidex-DEAE kolonnen, og de fleste av lipider var eluted med kloroform/metanol (3:2, v/v) eller kloroform/metanol/vann (3:6:1 av vol.)., PtdIns og PtdSer var eluted sammen med 0,03 M H3PO4 og uidentifiserte materiale med 0,1 M H3PO4. PtdIns(4)P var eluted med 0,25 M H3PO4 og PtdIns(4,5)P2 med 0,5 M H3PO4 som indikert av eluted radioaktivitet. Alle fraksjoner ble hentet med 0.4 ml vann/ml eluate. Den øvre fase var tilbake-ekstrahert med 0,1 vol. av kloroform. Den sammenslåtte kloroform faser ble vasket med 0.4 vol. 0,5 M HCl i 50% aq. metanol. Fraksjoner ble brukt for fastsettelse av molekylær arter av FAB/MS (se nedenfor).
Gunnarsson et al., (1997) brukes for normal fase HPLC med fordamping lys spredning gjenkjenning for analyse av kommersielle prøver av PtdInsPs sammen med andre fosfolipider. Ved bruk av en lineær gradient av En, kloroform/metanol/ammoniakk (50:45:3, ved vol.) og B, kloroform/metanol/vann/ammoniakk (25:55:17:3, ved vol.) vel løst slutten av nye topper for PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 er innhentet. Dose-respons-kurver for PtdIns(4)P og PtdIns(4,5)P2 ble ikke lineær, noe som er karakteristisk for lys spredning detektor (resultater ikke vist)., For de fleste formål HPLC-teknikk er overlegen i oppløsning, hastighet og generell støtte til DEAE-cellulose prosedyre og er metoden for valg hvis HPLC-utstyr er tilgjengelig. DEAE-cellulose er billige og storskala rensing kan kreve bruk av dette materialet. Den HPLC-prosedyren er også overlegen i forhold til noen eller alle måter til alternative prosedyrer for rensing av polyphosphoinositides, f.eks. preparative TLC eller neomycin affinitet kromatografi.