i April I år, er vi vitne til en av de mest monumentale prestasjoner i biologi: komplett sekvensering av det humane genom. Dekoding og database deponering av milliarder av baser i sekvensen er utgangspunktet for postsequence functional genomics. Oppdagelsen av den Periodiske Tabell hatt en viktig innvirkning på kjemi., Så også, komplett tyde på det menneskelige genom vil ha imponerende effekter på menneskers helse og livskvalitet. For øyeblikket har vi forstå funksjon av bare et begrenset antall av menneskelige gener. Å studere alle menneskelige gener-funksjonen er en teknologisk utfordring. For å møte denne utfordringen, ny høy gjennomstrømning verktøy har blitt utviklet. Den microarray-analysen er en kraftig molekylær teknologi som gjør det samtidig studie av uttrykk av tusenvis av gener eller deres RNA-produkter, noe som gir et nøyaktig bilde av genuttrykk i cellen eller eksempel på tidspunktet for undersøkelsen.,
For eksempel, uttrykket av alle gener for resistens og metabolisme eller alle de kjente omdanne cellene til kreftceller i en celle kan bli registrert og målt i samme tidsrom (Brown og Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Den microarray kan bli definert som en ordnet samling av microspots (probene), hver punkt inneholder et enkelt arter av nukleinsyre og representerer de gener som er av interesse. Denne teknologien er basert på hybridisering mellom merket med gratis målene som er utledet fra en biologisk prøve og en rekke av mange DNA-prober som er immobilisert på en matrise (Sørlige et al.,, 1999). Målene er produsert ved revers transkripsjon og samtidig merking av RNA utdrag fra en biologisk prøve hybridiserte med DNA-fragment prober. Den hybridisering signal produsert på hver probe er mRNA uttrykk nivået av det tilsvarende genet i utvalget på tidspunktet for undersøkelsen. Det er registrert signaler, kvantifiseres, integrert og normalisert med dedikert programvare og reflekterer ‘genuttrykk profil» eller «molekylære portrett» for hvert av biologisk prøve.,
Mange tusenvis eller titusenvis av forskjellige stedene kan skrives ut på en silisium eller glassplaten eller en nylon solid-state-base. Det er hovedsakelig to varianter av microarrays: cDNA og oligonukleotid microarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Selv om begge typer microarray er brukt til analyse av gen-uttrykk mønstre, disse variantene er fundamentalt forskjellig (Lipshutz et al., 1999). I cDNA microarrays, relativt lange DNA-molekyler som er immobilisert på en solid overflate. Denne typen av microarray er mest brukt for storskala screening og uttrykk studier., Den oligonukleotid microarray er fabrikkert av in situ lys-anvist kjemisk syntese eller ved konvensjonell syntese etterfulgt av immobilisering på en glass-matrise. Dette microarray brukes for påvisning av mutasjoner, genet kartlegging og uttrykk studier og åpner for forskjellsbehandling oppdagelsen av genet familiemedlemmer eller alternative transkripsjoner som ikke er gjenkjennelig med cDNA microarrays.
kjemi av microarray i seg selv er ikke ny, siden hybridisering teknologi har blitt godt etablert i flere tiår., Men samtidig studere tusenvis av gener forvandler microarray teknikk til et kraftig hele systemet analytiske verktøy. Nesten 10 år har gått siden den første microarrays ble opprettet, og likevel er denne teknologien er fortsatt å forbedre og fremme. Siden sin første innføring, antall microarray-programmer har økt (Figur 1). Starter fra deres bruk i genet screening og mål identifikasjon, og med denne teknologien er å finne nye applikasjoner som utviklingsbiologi, sykdom klassifisering, veien studier, drug discovery og toksikologi., Den teknologien som er involvert i produksjon og bruk av microarray er utenfor omfanget av denne gjennomgangen, men har blitt grundig gjennomgått andre steder (Schena et al. I 1995; Niemeyer og Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brun og Botstein, 1999; Celis et al. I 2000; Cheung et al. I 1999; Duggan et al. I 1999; Graver, 1999; Khan et al. I 1999; Hegde et al. I 2000; Meldrum, 2000). Vi beskriver her noen av de nyeste utviklingen og resultatene i microarray-teknologi i kreftforskning, diskutere potensielle problemer, og beskrive kliniske applikasjoner og kommentar på fremtiden for denne teknologien.,
Antall siteringer funnet i MEDLINE ved å sette ‘microarray’ (grå linje) eller «microarray+kreft» (hvit linje) for en PubMed-søk. Artiklene ble publisert mellom 1995 og 2002
viktigheten av å måle global genuttrykk i human kreft
Karakterisering av befolkningen i transkribert gener har ført til etableringen av et nytt begrep, det transcriptome (Su et al., 2002)., Dette konseptet definerer komplett sett av transkribert gener som er uttrykt som messenger RNAs for en bestemt art. Den transcriptome, derfor representerer universet av RNA budbringere som kan kode for proteiner. Bare ca 5% av genene som er aktive i en bestemt celle på et gitt tidspunkt. De fleste gener er undertrykt, og denne kontrollen kan skje ved enten transcriptional eller translasjonsforskning nivå. Siden regulering av protein uttrykk på nivå med transkripsjon er mer effektive, de fleste kontroll foregår på dette nivået., Den genuttrykk profil av en celle avgjør dens funksjon, fenotypen og respons på ytre stimuli. Derfor, genuttrykk profiler kan bidra til å belyse cellulære funksjoner, biokjemiske trasé og regulatoriske mekanismer. I tillegg, genuttrykk profiler av sykdom celler/vev, sammenlignet med vanlig kontroller, kan fremme forståelsen av sykdommen patologi og identifisere nye terapeutiske poeng av intervensjon, bedre diagnose og klargjørende prognose.,
i Løpet av de siste årene, og flere gene expression profiling metoder har dukket opp og har vært brukt til kreftforskning. Disse inkluderer differensial-skjerm, seriell analyse av genuttrykk og microarrays (Velculescu et al. I 1995; Granjeaud et al. I 1999; Cheng et al., 2002). Den microarrays har blitt viktig fordi de er enklere å bruke, krever ikke store DNA-sekvensering og la den parallelle kvantifisering av tusenvis av gener fra flere prøver., Gene expression profiling av kreft representerer den største kategorien av forskning ved hjelp av microarray-teknologi, og ser ut til å være den mest omfattende tilnærming for å karakterisere kreft molekylært. Selv om kreft fenotypen er bare delvis bestemt av dets transcriptome, det gir likevel et tydelig bilde av en celle er fysiologiske tilstand. I kraft av denne tilnærmingen har vært påvist i studier utført på et omfattende utvalg av malignitet, inkludert kreft i bryst, hode og nakke -, lever -, lunge -, eggstokk -, bukspyttkjertel -, prostata-og mage (Bhattacharjee et al., I 2001; Dhanasekaran et al. I 2001; Garber et al. I 2001; Tonin et al. I 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hippo et al., 2002; Luo et al., 2002a).,sammenliknet med den tilsvarende kontrollen eksempel for å måle forskjeller og likheter mellom både phenotypes, kreft lagdeling, der genuttrykk profiler fra ulike prøver av samme type kreft er i forhold til å avsløre forskjellige undergrupper for å bedre definere molekylær klassifisering av en vanlig histologisk type kreft, og til slutt timelige evaluering av svulsten, der genet uttrykk mønstre fra tumor eksempler hentet fra ulike stadier av utviklingen i forhold til å belyse forskjellene mellom de tidlige og avanserte stadier av sykdommen., Selv om mange studier av microarray analyse i human sykdom har vært publisert, og vi presenterer her noen av de som har en klinisk interesse for onkologi.
Microarray og prostata kreft
Flere studier med microarrays å karakterisere prostatakreft genuttrykk profiler har nylig blitt publisert. Disse studiene har brukt microarray-teknologi as et gen discovery-verktøy for å identifisere genetiske markører som diskriminerer mellom normal og prostata kreft vev., En enkel microarray-studien er utført ved hjelp oppdaget membran rekker å analysere normal og cancerous vev og cellelinjer (Bull et al., 2001). Membran microarray funn er begrenset av den relative insensitivitet av denne teknikken for å oppdage transkripsjoner uttrykt ved lave nivåer, og det lille antallet flekker som kan være plassert på membraner, men denne studien har gitt kandidat markører for prostata kreft for videre evaluering., Fem publiserte studier har analysert genuttrykk profiler i flere tusen gener i normal og prostata vev og brukes uten tilsyn hierarkisk klynging analyse for å sortere prøver (Dhanasekaran et al. I 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) var i stand til å skille normale prostata, benign prostatahyperplasi (BPH), lokalisert prostatakreft og metastatisk prostatakreft-eksempler ved å bruke 9,984 element-spotted microarrays. Ved hjelp av hierarkisk klynging analyse, Luo et al., (2001) var i stand til å diskriminere 16 prostatakreft prøver fra ni BPH prøvene på grunnlag av forskjeller i genuttrykk profiler målt på lag 6500 element-spotted cDNA microarrays. Welsh et al. (2001a) rapporterte en lignende sortering av normal og prostata ondartet vev-eksempler ved å bruke oligonukleotid microarrays. Det er interessant at alle de fem grupper identifiseres de transmembrane serin protease hepsin som viser signifikant økt uttrykk i ondartet vev sammenlignet med normalt prostatavev (Dhanasekaran et al. I 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al.,, 2001a; Singh et al., 2002). Mange andre kandidaten markører for prostata kreft som proto-onkogenet PIM1 har kommet fra andre studier, og blir videre etterforsket som en potensiell diagnostiske markører. Redusert PIM1 uttrykk på immunohistochemistry av prostata svulst prøvene er gitt en økt risiko for tilbakefall etter operasjonen (Dhanasekaran et al., 2001). Andre grupper som bruker kombinasjoner av subtraktive hybridisering og microarray analysen har identifisert flere mulige kandidater for prostata kreft immunmodulerende terapi inkludert prostein (Xu et al.,, 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) og p504S/Alfa-Methylacyl-CoA-Racemase (Jiang et al., 2001). I en fersk studie, Virolle et al. (2003) brukte en prostata kreft cellelinje som uttrykker en høy konstituerende nivå av Egr1 protein, en transkripsjonsfaktor overexpressed i de fleste aggressive tumorigenic prostata kreft celler. De vurderte Egr1 transcriptional regulering, ved å utføre et oligonukleotid microarray analyser ved hjelp av celler gjengitt mangelfull i Egr1 som sammenligningen prøve for identifisering av Egr1 mål gener., For første gang i prostata vev, denne studien bekreftet vekst-enhancer rollen Egr1 tidligere observert i andre cellulære systemer, og identifisert flere nye mål gener spesielt styre vekst, celle syklus progresjon og apoptotic trasé.
Microarray og oral kreft
Til dags dato, bare noen få microarray studier som er relevante for oral kreft har blitt publisert. Chang et al. (1998) illustrert bruk av cDNA microarrays å karakterisere transformasjon-relaterte gener i munnhulekreft. Villaret et al., har brukt en kombinasjon av komplementære DNA-subtraksjon og microarray-analyse for å vurdere unike gener som er spesifikke for plateepitelkarsinom i hode og hals (HNSCC) som potensielle tumor markører og vaksine kandidater. Ni kjente gener ble funnet å være betydelig overexpressed i HNSCC i forhold til normalt vev. I tillegg er fire roman gener var overexpressed i et delsett av svulster (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analyserte transcriptome i munnhulen plateepitelkarsinom., De finnes ca 600 kandidat gener (omdanne cellene til kreftceller, svulst suppressors, transkripsjon faktorer, differensiering markører, metastatisk proteiner og xenobiotic enzymer) som ble differentially uttrykt i kreft i munnhulen, validere bare tre av disse gener med PCR.
Lu et al. (2001) brukte microarray tilnærming for å evaluere genuttrykk profil endringer under initiering og utvikling av plateepitelkarsinom i spiserøret., De undersøkt genuttrykk profiler i ulike stadier av oppstart og progresjon av esophageal kreft for å identifisere gener differentially uttrykt mellom disse stadiene. Frierson et al. (2002) brukt oligonukleotid microarray-analyse for å studere uttrykk for 8,920 ulike menneskelige gener i 15 adenoid cystisk karsinom (ACCs), en ACC-celle-linje og fem normal store spyttkjertler., Blant gener med endret uttrykk i ACC var de koding transkripsjon faktorer SOX4 og AP-2 gamma, kasein kinase 1 så vel som epsilon og frizzled-7, som begge er medlemmer av Wnt/beta-catenin signaliserer veien. I en fersk studie, Leethanakul et al. (2003) generert av høy kompleksitet cDNA biblioteker fra laser fange microdissected normal og cancerous plateepitelkreft epitel. I denne studien, forfatterne undersøkte tilgjengelig sekvens informasjon ved hjelp av bioinformatic verktøy og identifisert 168 roman gener differentially uttrykt i normale og maligne epitel., Videre, ved hjelp av cDNA-matriser, de fikk bevis for at et delsett av disse nye gener kan være svært uttrykt i HNSCC.
Microarray og brystkreft
Gitt den kliniske mangfold av brystkreft, microarray-teknologi kan være et ideelt instrument for å etablere en mer presis klassifisering. Innledende studier med microarray-basert uttrykk profilering vist sin evne til korrekt å klassifisere østrogen reseptor-negative og østrogen reseptor-positiv brystkreft (Perou et al. I 2000; West et al.,, 2001) og for å skille BRCA1-relaterte svulster fra BRCA2-relaterte og sporadiske svulster (Hedenfalk et al. I 2001; van ikke Dreier et al., 2002).
studier av van ikke Dreier et al. har vært en av de mest omfattende og informativ studier utført hittil. Forfatterne undersøkte 117 primære bryst prøver av microarray-basert gene expression profiling å utvikle prognostiske profiler og sammenligne disse med kjente prognostiske markører i brystkreft. Ut av de 5 000 gener med variabel uttrykk profiler, 70 ble identifisert for optimal nøyaktighet i å forutsi tilbakevendende sykdom., Ved hjelp av denne klassifiseringen, forfatterne gjettet riktig faktiske utfallet av sykdom for 65 ut av 78 pasienter. Fem pasienter med god prognose og åtte pasienter med dårlig prognose ble feil tildelt. Standard prognostiske markører i brystkreft ble brukt til å anslå risiko for kreft tilbakefall og bidra til å gjøre beslutninger om adjuvant behandling. Dessverre, gjeldende prognostiske markører ikke tilstrekkelig til å identifisere de mest riktig behandling for pasienten., Prediktiv kraft av microarray tilnærming er mye større enn det er i dag brukt nærmer seg, men det må være validert i flere prospektive kliniske studier. Hvis den prognostiske verdien av denne tilnærmingen ble bekreftet, uttrykk-profilering classifier vil resultere i om en fire-brett reduksjon i pasienter som får adjuvant behandling unødvendig (Caldas og Aparicio, 2002).
Martin et al. (2001) beskrevet en metode for å identifisere sirkulerer brystkreft ved en to-trinns prosess av differensial-skjerm og høy følsomhet array-basert uttrykk profilering., Selv om potensialet i denne teknikken er lovende, følsomhet og spesifisitet fortsatt trenger å bli bedre og mer arbeid er nødvendig for å avgjøre den kliniske betydningen av genuttrykk profil oppdagelse i perifert blod. Noen artikler har nå vist en sammenheng mellom svulst uttrykk profiler ved hjelp av microarray-teknologi og klinisk utfall. For eksempel, Sorlie et al. (2001) viste at svulsten underklasser definert ved uttrykket profilering kan forutsi sykdom-fri og total overlevelse, og Sotiriou et al., (2002) viste at forbehandling uttrykk profiler spådd klinisk respons på kjemoterapi i et lite utvalg av brystkreft svulster. Selv om studiet av Sorlie et al. var veldig provoserende, forfatterne ikke sammenligne den prognostiske verdien av gruppene identifiseres ved hierarkisk klynging med i dag brukes prognostiske faktorer ved brystkreft., Siden resistens i kreft er et stort hinder for å lykkes kjemoterapi, muligheten for å få en potensiell molekylær-profil, eller fingeravtrykk av kreft medisiner i kreft celler av microarray-teknologi er avgjørende for å forutsi kjemoterapi respons. Kudoh et al. (2000) viste denne evnen til å definere endringer i genuttrykk profiler i bryst-kreft celle-linje behandlet med kjemoterapi. De overvåket uttrykk profiler av MCF-7 brystkreft celler som enten var kortvarig behandlet med doxorubicin eller valgt for motstand mot doxorubicin., Denne studien viste at forbigående behandling med doxorubicin endret uttrykk for en variert gruppe av gener i en tid-avhengig måte.
Microarray og eggstokkreft
i Løpet av de siste årene, og flere etterforskere har publisert interessante studier vedrørende uttrykk profilering av ovarian kreft. Martoglio et al. (2000) analyserte genuttrykk profiler av fem normale ovarier og fire dårlig differensiert seriøst papillar ovarian adenocarcinoma prøver., Ved hjelp av en liten ‘in-house’ nylon membran cDNA microarray, fant de en økning i angiogenese-relaterte markører (f.eks. angiopoietin-1, VEGF), apoptotic og neoplastiske markører, immunrespons meklere og nye potensielle markører for ovarian kreft (f.eks. cofilin, moesin og neuron-restriktive lyddemper faktor protein) i kreft vev. Studien var spennende fordi de brukte en lav-kost cDNA utvalg skreddersydd for studier av spesifikke trasé, slik som angiogenese og tumorigenesis., Siden det er problematisk å få tilgang til en tilstrekkelig mengde tidlig ovarian tumor vev, forskere brukt ulike strategier for å omgå behovet av vev beløp som vanligvis kreves av microarray analyse. For eksempel, Ismail et al. (2000) rapporterte en studie av 864 DNA-elementer skjermet mot 10 ovarian kreft celler linjer og fem normal epithelial celle linjer ved hjelp av kortsiktige cellekultur for å utvide ovarian overflate epitel før RNA-ekstraksjon., Andre undersøkere renset ovarian epitel ved in vitro-prosedyrer, for eksempel overholdelse av glass eller immunomagnetiske berikelse (Ono et al. I 2000; Welsh et al., 2001b). Imidlertid, disse to tilnærmingene kan introdusere skjevheter i observert genuttrykk. Faktisk, den første tilnærming (Ismail et al., 2000) bruker kultivert kreft celler, som kanskje ikke reflektere in vivo kreft på grunn av muligheten for videregående genuttrykk endringer som skjer in vitro-som et resultat av kultur betingelser. Den andre strategien (Ono et al. I 2000; Welsh et al.,, 2001b) er svært lang, og det kan resultere i forringelse av mindre stabile RNA budbringere. For å unngå mulige skjevheter iboende i in vitro kulturer brukt i noen studier (Ismail et al. I 2000; Matei et al., 2002), andre forskere har undersøkt genuttrykk mønstre direkte fra kirurgisk avkappede svulster (Shridhar et al., 2001). Små, spesialiserte microarrays har flere praktiske fordeler, og kan avsløre informasjon som kan gå tapt i større microarrays. Sawiris et al., (2002) brukte en høyt spesialisert cDNA microarray kalt «Ovachip’, og fant denne microarray ekstremt følsom på å skille eggstokkreft fra kreft i tykktarmen basert på gen-uttrykk mønstre. Screening biomarkører for ovarian kreft er svært viktig på grunn av sent stadium ved diagnose og dårlig overlevelse forbundet med denne type kreft., Nylig, to studier som brukes microarray-teknologi for å identifisere to overexpressed potensielle ovarian kreft serum markører kalt osteopontin og prostasin, og rapporteres foreløpig validering av deres bruk for tidlig påvisning av sykdommen (Mok et al. I 2001; Kim et al., 2002).
Microarray og andre kreftformer
anvendelsen av microarray-teknologi til andre menneskelige kreft er raskt voksende. Den banebrytende studie av Golub et al., (1999) viste muligheten til å skille mellom akutt myelogen leukemi og akutt lymfoblastisk leukemi (ALL) basert på genuttrykk overvåking og hvordan, i en simulert situasjon «blindet» til histologisk diagnose, to klasser kunne ha blitt oppdaget av genuttrykk mønstre alene. Alizadeh et al. (2000) har identifisert de to former for diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) på grunnlag av genuttrykk profiler som er en indikasjon på forskjellige stadier av B-celle differensiering., Interessant, kan dette molekylær klassifisering har prognostisk verdi uavhengig av lagdelingen av vanlige kliniske vurdering. Å studere genuttrykk i lymfoide malignitet, et stort felles gruppe opprettet en spesialisert microarray, kalt ‘Lymphochip’, som er beriket i gener som er selektivt uttrykt i lymfocytter og i gener som regulerer lymfocytt-funksjonen (Alizadeh et al., 1999). Denne gruppen har brukt dette microarray å undersøke DLBCL og fant to molekylært ulike former av denne svulsten., Videre har de vist at de DLBCL undergrupper definert en undergruppe av pasienter med tydelige kliniske prognose. For å teste hypotesen om at B-cellen kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er mer enn én sykdom, Rosenwald et al. (2001) knyttet genet uttrykk mønstre av CLL til sine Ig mutational status og andre typer av normale og maligne B-celler. Interessant, gener identifisert som svært uttrykt i CLL i forhold til DLBCL ble uttrykt samme i alle CLL prøver uavhengig av deres Ig mutational status., Denne studien antydet at alle CLL tilfeller delte en felles mekanisme for transformasjon og/eller celle av opprinnelse. En nyere studie (Stratowa et al., 2001) har foreslått en liste over potensielle nye prognostiske markører som er involvert i lymfocytt menneskehandel, og som er assosiert med sykdom regi og/eller pasienten overlevelse.
I en fersk studie, Gariboldi et al. (2003) analyserte genuttrykk profiler i normalt vev av huden tumor-mottakelige og resistente mus for å identifisere gener som spiller en funksjonell rolle i genetisk mottakelighet., Denne studien har foreslått en rolle av Scca2 genet, et medlem av serin protease inhibitor superfamily, i den genetiske predisposisjon for hud svulster.
Microarray-teknologi har også blitt brukt i analysen av melanom (Bittner et al., 2000). Denne studien antydet at genuttrykk profiler innenfor en enkelt pasientens vev kan være utrolig bevart over tid, og at global protokoll analyse kan identifisere ukjente undergrupper av cutaneous melanoma og forutsi eksperimentelt etterprøvbare phenotypical egenskaper.,
Studier på kreft i tykktarmen celler og vev vist betydelig undertrykkelse av kinase-genet, WEE1Hu (Backert et al., 1999).
Mange transcriptomes endre etter bestemte overexpression av tumor-relaterte gener. For eksempel, har vi benyttet et adenovirus-mediert uttrykk system av RB2/p130 tumor-suppressor gen i en ikke-liten lunge kreft celle-linje for å identifisere spesifikke gener som er regulert av pRb2/p130 (Russo et al., 2003)., Våre microarray resultatene har identifisert en rekke gener som er involvert i mange cellulære prosesser, inkludert celledeling, celle signaliserer/celle kommunikasjon, celle-struktur/motilitet og genuttrykk og metabolisme. Disse resultatene antyder at nye potensielle terapeutiske biomarkører i lungekarsinom. Videre resultatene av en annen cDNA microarray studie tyder på at overexpression av tumor-suppressor gen PTEN kan forhindre lungekreft invasjon av downregulating et panel av gener (Hong et al., 2000)., I lys av de ovennevnte data, er det klart at microarray tilnærming er svært viktig i en analyse av et utvalg av tumor typer.