Innledning
Ambra, en kjent naturlig produkt av spermhval , er også funnet som flotsam og betsam på strender over hele verden , og har vært høyt verdsatt for sin nytteverdi i parfyme industrien . Selv om det har lenge vært holdt som flotsam og betsam ambergris samlet på strendene stammer fra spermhval , liten eller ingen bevis for at dette noen gang har vært publisert, og forskjeller finnes mellom slike prøver, og prøver av ambra direkte tatt fra spermhval., For eksempel, flotsam og betsam ambergris prøvene inneholder vanligvis mye høyere andeler av det triterpenoid alkohol ambrein og mye lavere andel av plantesteroler enn prøver av ambra fra spermhval . Tvert om, flotsam og betsam ambergris noen ganger inneholder fragmenter av blekksprut nebb , og siden cephalopods, for eksempel blekksprut, utgjør den store kosttilskudd del av spermhval, dette har blitt sitert som bevis for en opprinnelse av flotsam og betsam coproliths fra spermhval. Det er også en teori om ambra kan oppstå som en patologisk sekresjon fra den irriterende av den harde blekksprut nebb chitin ., Imidlertid, andre marine pattedyr (f.eks. medlemmer av Globicephala og Ziphiidae) også predate på blekksprut , og noen (inkludert dverg og pygme spermhval) er også nevnt som potensielle kilder til ambra . Derfor, for å ytterligere belyse opprinnelsen til flotsam og betsam ambra, har vi analysert DNA fra en ambergris eksempel hentet fra en spermhval strandet i Nederland og sammenlignet det med DNA-sekvenser som er isolert fra flotsam og betsam ambergris som samles inn fra strendene i New Zealand og Sri Lanka.,
Ambergris er holdt for å være overveiende består av ambrein på grunn av sin produksjon fra squalene, en felles metabolsk produkt i mange organismer . Denne prosessen kan være forårsaket av gut mikrober innflytelse, og utfellinger i tett, solid massene innenfor hval-kolon . Den coprolitic avleiringer at resultatet er compositionally godt egnet til å ta vare på DNA fra colon siden ambrein er hydrofobe og tilsynelatende motstandsdyktig mot nedbrytning i det sure enteric miljø., Bevis fra radiocarbon dating sikkert angir motstand mot mikrobielle og foto-nedbrytning i det marine miljø for opp til et millennium i noen flotsam og betsam ambergris prøver . Vi har en hypotese om at slikt materiale kan gi en gunstig buffer for å bevare DNA, selv etter langvarig eksponering for ugunstige forhold på sjøen.
Materiale og metoder
flotsam og betsam ambergris prøver fra Nordsjøen, det Indiske Hav og Stillehavet ble analysert, som representerer materialet er global distribusjon ., Tre flotsam og betsam ambergris prøver (en fra Sri Lanka, to fra Pitt Island, New Zealand) var subsampled for DNA-ekstraksjon. En fjerde prøven stammer fra disseksjon av en mannlig sæd hval strandet i desember 2012, kl Razende Bol i nærheten Texel, Nederland. Den siste «ferskt» ambra, fra en bekreftet spermhval kadaveret, gitt et kjent forhold til flotsam og betsam prøver med ubekreftet biologiske historie. Prøver av ambra ble innhentet og analysert for ambrein og fekalier sterol innholdet i tidligere studier .,
DNA-ekstraksjon og sekvensering ble gjennomført på KLODEN Institutt, Universitetet i København, i en dedikert gamle DNA-laboratorium følge strenge rutiner for minimalisering av forurensning. Ca 120 mg var subsampled (figur 1 og tabell 1) for DNA-ekstraksjon. Prøvene ble inkubert i 400 µl proteinase K- – som inneholder buffer følgende Gilbert et al. ved 56°C i 10 h; supernatants ble deretter behandlet ved hjelp av fenol–kloroform trinn følgende Carøe et al., og renset ved hjelp av Monarch DNA Opprydding Kolonner (5 µg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) i henhold til produsentens retningslinjer. Dobbel-strandet biblioteker ble bygget fra DNA-ekstrakter etter den BESTE protokollen , utviklet og utprøvd spesielt for sekvensering av gamle og degradert DNA. Bibliotekene ble forsterket og indeksert gjennom PCR ved hjelp av PfuTurbo Cx Hotstart (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens retningslinjer., Produktene ble samlet på ekvimolare konsentrasjon før sekvensering på en Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA) – plattform, ved hjelp av 80 bp enkelt slutten lese kjemi ved det danske Nasjonale Høy gjennomstrømning DNA-Sekvensering Sentrum, København, Danmark.
Figur 1. Detaljer for ambergris de analyserte prøvene. (en) Kart som viser lokaliteter hvor ambergris prøvene ble opprinnelig funnet., (b) Bilder som viser stort mangfold i fysiske egenskaper av ambra fragmenter: TEXEL151212 (fra dissekert hval-prøven) ble kornete i konsistensen, mens flotsam og betsam prøver overfladisk dukket opp mer tett og heterogene, og var internt equigranular og betydelig lysere i farge.
| eksempel | sted | total masse (g) | analysert masse (mg) | % ambrein |
|---|---|---|---|---|
| S. 01 | Pitt Island, New Zealand | 50 | 96 | 92 |
| S.,02 | 20 | 110 | 83 | |
| S.,03 | vest Sri Lanka | 101 | 188 | 60 |
| TEXEL151212 | Texel, Nederland | 83000 | 92 | 93 |
| eksempel | sum opptjent leser | gjennomsnittlig opptjent les lengde (bp) | sum justert leser (mtDNA) | ganger dekning (mtDNA) | sum justert leser (hele genom) | ganger dekning (hele genom) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| S.,01 | 77 261 083 | 72.9 | 43 | 0.175 | 12 782 | 0.0000546 |
| S. 02 | 89 486 411 | 71.7 | 2440 | 1.648 | 26 169 | 0.000135 |
| S.,03 | 71 907 406 | 68.3 | 40 235 | 9.717 | 2 447 082 | 0.00426 |
| TEXEL151212 | 92 385 587 | 62.6 | 71 190 | 19.654 | 3 099 642 | 0.,00639 |
Sekvens analyse ble gjennomført på high-performance computing anlegget ved Universitetet i København, med FASTQ filene er behandlet med PALEOMIX rørledning (v. 1.2.13) . FastQC v. 0.11.8 ble opprinnelig brukt til kvalitetskontroll av raw-sekvens data. Adaptere var kantet med AdapterRemoval v. 2.3.1 , med leser mindre enn 25 bp også fjernet. Leser så ble tilordnet referanse sekvenser ved hjelp av BWA , også kommer til anvendelse mapDamage2.,0 for grunnleggende nedbrytning kvantifisering, produsere justeringer med referanser sekvenser. ANGSD ble deretter brukt til å produsere sekvenser i FASTA-format.
Usikkerhet rundt opprinnelse og biologiske mekanismer for produksjon av ambra bedt oss om å vurdere flere mulige kandidat cetacean og pinniped arter i sekvens analyse. Arter identitet var det fremgår av kartlegging suksess og fylogenetisk forholdet til 19 cetacean og pinniped kandidat arter i NCBI RefSeq (se den elektroniske supplerende materiale)., Disse artene ble valgt ut basert på potensiell egnethet som dyp-dykking marine pattedyr fylle en tilsvarende økologiske nisje til spermhval, for å utelukke slike arter blir co-tilpasset for å produsere ambra. Eksempel sekvenser ble sammensatt og justert ved hjelp av MAFFT v. 7.392 . Fylogenetisk tre modellene ble deretter produsert i MEGA X ved hjelp av maximum-likelihood-metoden med Hasegawa–Kishino–Yano modell , med avstander anslått av maksimal kompositt sannsynligheten tilnærming (detaljer av alle referanse-sekvenser som brukes er inkludert i den elektroniske supplerende materiale).,
Resultater
Den fylogenetisk analyse utvetydig støttet spermhval opprinnelse av de fire ambergris prøvene (figur 2; elektronisk supplerende materiale, figur S1). På samme måte, i samsvar med den Physeter macrocephalus mitokondrie referanse genome fra NCBI (NC_002503.2) produsert høyest dekning resultater for alle prøver av alle justeringer er gjort og gir en trygg attribusjon, men med betydelige variasjoner i suksessen mellom prøvene. Sekvensering av prøve fra en strandet spermhval (TEXEL151212) produsert av langt høyest dekning (ca., 20×) for spermhval mitokondrium, mens en av flotsam og betsam prøver fra Pitt Island (S. 01) bare ga ca 0.2× dekning (se tabell 2). Justeringer med Kogia sima (dverg spermhval) og Kogia breviceps (pygmy spermhval) referanse mitokondrie genomer (NC_041303.1, NC_005272.1) også gitt dekning (detaljer i elektronisk supplerende materiale), selv om mange svært bevart funksjonelle regioner er delt mellom analysert for arter, noe som resulterer i høy sekvens likhet . Imidlertid dekning for kogiid arter var som regel rundt en faktor av 10 mindre enn for Physeter., Justering med P. macrocephalus hele kjernefysiske referanse genom (ASM283717v2) var også vellykket, selv om dette er mer tydelig i sammenligninger av totalt antall lesninger er tilordnet til genom. Justering for Architeuthis dux (giant squid), en kjent vanlige byttedyr for spermhval (f.eks. ), ble mislykket, men dette er ikke deres dominerende byttedyr .
Figur 2. Maximum-likelihood-fylogenetisk tre-modellen er generert fra referanse-sekvenser og justert eksempel mitokondrie genomer., Prøvene er klart ligger som en gruppering med spermhval (S. macrocephalus) snarere enn dverg og pygme spermhval (Kogia spp.). Dette treet reflekterer den høyeste log-likelihood-modell, verdier reflekterer andelen av trær beregnet som er knyttet taksa ble gruppert, noe som indikerer tillit i posisjon, og gren lengder måle antall bytter på hvert sted (se skala). Figur produsert i MEGA-X . Hval skildringer fra: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sperm whales_size.svg., Et fylogenetisk tre inkluderer alle 19 kandidat arter er presentert i elektronisk supplerende materiale, figur S1.
Resultatene fra MapDamage viser bemerkelsesverdig lite inter-eksempel variasjon påvirker C til T overganger i 5′ strand ender, men en høyere andel av G til En overganger ved 3′ – enden finnes for S. 01 (detaljer i elektronisk supplerende materiale, figur S2), noe som indikerer mulig høyere biomolecular nedbrytning., Generelt, men svært lite kjemisk endring som har skjedd, og fordelingen av endringer over tråder forblir jevn og flat.
Diskusjon
Denne studien har vist at tre flotsam og betsam ambergris prøver kan trygt tilskrives spermhval gjennom DNA-ekstraksjon. Mens bekreftelse av en spermhval opprinnelse for flotsam og betsam ambergris er ikke et overraskende resultat, er den foreliggende studien er den første som gir en betydelig proof-of-concept hente endogene DNA fra ambra og klarer å bruke det for organismen identifikasjon., Viktigere, opprinnelsen til alle tre flotsam og betsam ambergris prøver studert her kan du enkelt bli identifisert som spermhval på grunnlag av ikke bare genetisk justering suksess, men også modellering av mitokondrie genomer i fylogenetisk relatedness trær, inkludert et stort utvalg av outgroup marine pattedyr taksa., Imidlertid, selv om alle prøver som er analysert her ble identifisert som opprinnelse fra spermhval, det er fortsatt fullt mulig at andre nært beslektede dyp-dykking marine pattedyr (slik som dverg og pygme spermhval) kan produsere ambra og har bare fortsatt ikke blitt registrert som gjør det til dags dato.
Den dominerende årsaken til den dramatiske variasjon i genetisk dekning sett mellom prøvene er uklart. Analyse av DNA-nedbrytning i mapDamage2.,0 viser liten sammenheng med justering forsikringer, som kan forventes, og det er også liten variasjon mellom ambrein innhold i prøvene som kunne forventes å bidra til differensial DNA bevaring. Den nøyaktige alder av dagens flotsam og betsam prøvene er ukjent, selv om tidligere studier har med hell radiocarbon datert andre ambergris prøver . Imidlertid, radiocarbon dating av relativt nylige eksempler er problematisk på grunn av virkningen av fossilt drivstoff utslipp , og radiocarbon dates siden økningen av anthropic karbon-utslipp er upålitelige., Å produsere en konsekvent nedbrytning pris for G til En overganger i en pålitelig datert eldre prøvene kan, i fremtiden, bistand en bedre forståelse av differensial-DNA-skade. Et annet alternativ for fremtidig forskning kan være studier av glutamin deamidation og asparaginsyre racemization fra analyse av organiske peptider muligens også til stede i ambergris . Alternativt, men intra-eksempel variasjon i DNA og ambrein konsentrasjon kanskje like sannsynlig konto for lav dekning i utvalg S.,01, mens nyere eksponering for spermhval vev utvilsomt står for høy dekning i beached hval eksempel TEXEL151212.
preservational potensialet i ambrein utfellinger for DNA strekker seg ikke bare til endogene hval genetikk, men også for å metagenomic dekning av hval gut microbiome, og potensielt også DNA av byttedyr. For eksempel DNA-et kan også være i delvis eller ufordøyd blekksprut nebb funnet i spermhval avføring , og i ambra , som er enda en teori for å være en patologisk årsaken til ambergris sekresjon ., Forståelse av prokaryotic sammensetningen av microbiome miljø i ambergris kan også ytterligere belyse opprinnelsen av ambra, spesielt i konvertering av squalene å ambrein og den prosessen som ambergris ser ut til å danne lag på lag av belegg. Ytterligere analyser på endogene DNA henting fra flotsam og betsam ambra, herunder også DNA fra hval gut microbiota og byttedyr, vil gi betydelig større innsikt i spermhval økologi, evolusjon og metabolisme.,
Konklusjon
flotsam og betsam ambra har lenge vært en gåtefull materiale, gjenstand for diskusjon og analyser av vitenskapelige publikasjoner siden det attende århundre . Denne studien er den første til vår kunnskap til å presentere endelig bekreftelse av biologisk opprinnelse av flotsam og betsam ambergris prøver som spermhval, gjennom DNA-analyse. Utover dette, men denne studien legger ut potensialet av ambra som en ny kilde av genetiske data i slekt å spermhval, med en betydelig levetid over tid., Større klarlegging gjenstår å bli oppnådd gjennom studie av preservational forhold av DNA i ambrein og av partielle effekter av flere faktorer. Men de potensielle virkningene for å hjelpe vår forståelse av fortiden populasjonsdynamikk hos hval og deres økologisk forbundet taksa kan være dyp. Den eldste kjente ambergris funnet i løpet av Pleistocenepoken innskudd har permineralized blekksprut nebb inneholder aminosyrer endogene til blekksprut, som forfatterne attributt til preservational kapasiteten til lokale sediment ., Selv om det er lite sannsynlig at DNA vil bli bevart for en slik alder (1.75 Ma), dette funnet kan også være knyttet til effektiviteten av ambra og ambrein som preservational underlag. Mye er fortsatt ukjent om økologi og tilpasning av marine giants tidligere karakterisert som semi-mytiske beist, og ambra kan nå vise seg å være en liten, men signifikant nøkkelen til å forstå noen ytterligere aspekter ved dem.
Etikk
Alle prøvene ble innhentet og analysert ut fra et etisk synspunkt i denne studien, som er en del av DNRF-128 PROTEIOS prosjektet., Av de fire ambergris prøvene som er analysert i denne studien, tre (S. 01–S. 03) var subsampled fra materiale studert av S. J. R. i tidligere publikasjoner (se ovenfor), oppnådd som flotsam og betsam ambergris funnet på strender (eksempel nos ACL102-S. 01, ACL103-S. 02 og ACL237-S. 03). Den fjerde prøven (TEXEL151212) ble velvillig gitt som en subsample av ambergris prøven TEXEL151212 av Dr. A. Oosterbaan på vegne av EcoMare Museum, Texel, Nederland, hvor resten av denne prøven er holdt fortsatt. Vi er takknemlige for museets tillatelse til å bruke denne prøven.,
Data tilgjengelighet
Forfatternes bidrag
Konkurrerende interesser
Vi erklærer at vi ikke har noen konkurrerende interesser.
Midler
Finansiering ble gitt av den danske National Research Foundation gi PROTEIOS (DNRF128).
Takk
R. M. er takknemlig til Dr J. A. Samaniego for råd om genomisk analyse, og også til M. McCarthy for råd og diskusjoner. Vi er takknemlige for Dr A. Oosterbaan (Ecomare Museum, Texel) for eksempel S. 04 og til anonym samlere for prøver S. 01–S. 03., Forfatterne vil takke for den hjelp av den danske Nasjonale Høy Gjennomstrømning Sekvensering Sentrum i Illumina data generasjon.
Fotnoter
Elektronisk supplerende materiale som er tilgjengelig online på https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4828272.
Utgitt av the Royal Society i henhold til vilkårene i Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, som tillater ubegrenset bruk, forutsatt at den opprinnelige forfatter og kilde er kreditert.