Jorden er hjem for millioner av bakteriearter, hver med unike egenskaper. Å identifisere disse artene er kritiske i vurdering av jordprøver. Leger må også skille mellom ulike bakteriearter til å diagnostisere infiserte pasienter.
for Å identifisere bakterier, et utvalg av teknikker som kan benyttes, herunder mikroskopisk observasjon av morfologi eller vekst på en bestemt media til å observere koloni morfologi., Genetiske analyser, en annen teknikk for å identifisere bakterier har vokst i popularitet de siste årene, delvis på grunn av 16S ribosom-RNA-gen sekvenser.
bakteriell ribosomet er et protein RNA kompleks bestående av to underenhetene. 30 subunit, den minste av disse to underenhetene, inneholder 16S rRNA, som er kodet av 16S rRNA-genet finnes i genomisk DNA. Spesifikke regioner av 16S rRNA er svært bevart, på grunn av deres viktige funksjon i ribosomet montering. Mens andre regioner, mindre kritiske til å fungere, kan variere blant bakteriearter., Den variable regioner i 16S rRNA, kan tjene som unike molekylære fingeravtrykk for bakterie-arter, tillater oss å skille phenotypically identiske stammer.
Etter å ha fått en kvalitet utvalg av gDNA, PCR av 16S rRNA-koding-genet kan begynne. PCR er en vanlig brukt molekylærbiologisk metode, som består av sykluser av denaturering av dobbel-strandet DNA-templat, avspenning av universal primer par, som kan forsterke svært konserverte regioner av genet, og utvidelse av primere av DNA-polymerase., Mens noen primere forsterke de fleste av 16S rRNA-koding genet, andre bare forsterke fragmenter av det. Etter PCR-produktene kan analyseres via agarose gel elektroforese. Hvis forsterkning var vellykket, gel bør inneholde en enkelt band av en forventet størrelse, avhengig av primerpar som brukes, opp til 1500bp, omtrentlig lengde av 16S rRNA-genet.
Etter rensing og sekvensering, og fikk sekvenser kan deretter bli lagt inn i BLAST databasen, der de kan sammenlignes med referanse 16S rRNA-sekvenser., Som denne databasen returnerer matcher basert på den høyeste likhet, dette gjør at bekreftelse av identiteten av bakterier som er av interesse. I denne videoen, vil du observere 16S rRNA-genet sekvensering, inkludert PCR, DNA sekvens analyse og redigering, sekvens montering og databasesøk.
Ved håndtering av mikroorganismer, er det viktig å følge god mikrobiologisk praksis, blant annet ved bruk av aseptisk teknikk og bruk riktig personlig verneutstyr. Etter å ha utført en egnet risikovurdering for mikroorganismen eller miljømessige eksempel av interesse, få en test kultur., I dette eksemplet er en ren kultur av Bacillus subtilis er brukt.
for Å begynne, øke den mikroorganismen på et egnet medium i de aktuelle forhold. I dette eksemplet, Bacillus subtilis 168 dyrkes i LB buljong over natten i en risting inkubator satt til 200 rpm ved 37 grader Celsius. Neste, må du bruke en kommersielt tilgjengelig kit for å isolere genomisk DNA eller gDNA fra 1,5 milliliter av B. subtilis over natten kultur.
for Å sjekke kvaliteten av isolert DNA, første mix fem microliters av isolert gDNA med en microliter av DNA-gel loading dye. Deretter, legg prøven på en 0.,8% agarose-gel, som inneholder DNA farging reagens, som SYBR trygt eller EtBr. Etter dette, laste en kilobase molekylære massen standard på gelen, og kjøre elektroforese til forsiden fargestoff er ca 0,5 cm fra bunnen av gel. Når gel elektroforese er fullført, visualisere gel på et blått lys transilluminator. Den gDNA skal vises som en tykk band, over 10 kilobase i størrelse og har minimalt med søl.
Etter dette, for å skape serielle fortynninger av gDNA, etikett tre mikrosentrifuge rør som 10X, 100X, og 1000X., Så, bruk en pipette til å dispensere 90 microliters av sterilt destillert vann i hvert av rørene. Neste, legg til 10 microliters av gDNA løsning til 10X rør. Pipetten hele volumet opp og ned for å sikre at løsningen er blandet godt. Deretter, fjerne 10 microliters av løsningen fra 10X rør og overføre dette til 100X rør. Bland løsningen som er beskrevet tidligere. Til slutt, overføre 10 microliters av løsningen i 100X rør, til 1000X rør.
for Å begynne PCR-protokollen, tin den nødvendige reagenser på is. Deretter forberede PCR master mix., Siden DNA-polymerase er aktiv i romtemperatur, reaksjonen satt opp må skje på is. Delprøve 49 microliters av master mix i hvert PCR-rør. Legg så til en microliter av malen til hver av de eksperimentelle rør og en microliter av sterilt vann til den negative kontrollen rør, pipettering opp og ned for å blande. Etter dette, kan du angi PCR-maskinen i henhold til programmet som er beskrevet i tabellen. Plasser rørene i thermocycler og start programmet.,
Når programmet er fullført, kan du undersøke kvaliteten på produktet via agarose gel elektroforese, som tidligere vist. En vellykket reaksjon ved hjelp av det som er beskrevet protokollen skal gi et enkelt band på rundt 1,5 kilobase. I dette eksemplet eksempel inneholder 100X utvannet gDNA gitt den høyeste kvalitet. Neste, rense den beste PCR-produkt, i dette tilfellet, 100X gDNA, med en kommersielt tilgjengelig kit. Nå PCR-produktet kan sendes til sekvensering.
I dette eksempelet, PCR-produktet er sekvensert med forover og i revers primere., Dermed, to datasettene, som hver inneholder en DNA-sekvens og et DNA chromatogram, genereres: én for forward primer og den andre for revers primer. Første, undersøke chromatograms generert fra hver primer. En ideell chromatogram skal ha jevnt fordelt topper med liten eller ingen bakgrunn signaler.
Hvis chromatograms vise doble topper, flere DNA-maler kan ha vært til stede i PCR-produkter og sekvensen skal kastes. Hvis chromatograms inneholdt toppene av forskjellige farger i den samme posisjon, sekvensering programvare sannsynlig miscalled nukleotider., Denne feilen kan være manuelt identifisert og korrigert i tekst-fil. Tilstedeværelsen av brede toppene i chromatogram indikerer et tap av oppløsning, noe som fører til miscounting av nukleotider i tilknyttede områder. Denne feilen er vanskelig å riktig og samsvarer ikke i noen av de påfølgende trinnene bør behandles som upålitelige. Dårlig chromatogram å lese kvalitet, indikert av tilstedeværelse av flere topper, oppstår vanligvis på fem prime og tre prime endene av sekvensen. Noen sekvensering programmer fjerne disse lav kvalitet seksjoner automatisk., Hvis sekvensen var ikke avkortet automatisk identifisere den lave kvaliteten fragmenter og fjerne sine respektive baser fra tekst-fil.
Bruk en DNA-assembly-program for å sette sammen de to primer sekvenser i en sammenhengende sekvens. Husk, sekvenser som oppnås ved hjelp forover og i revers primere skal delvis overlapper hverandre. I DNA-et assembly-program, sett inn de to sekvenser i FASTA-format inn i den aktuelle boksen. Deretter klikke på send-knappen og vent til programmet for å returnere resultater.
for Å vise samlet rekkefølge, klikker du på Contigs i kategorien resultater., Så, for å vise detaljene for plasseringen, velger montering detaljer. Gå til nettstedet for basic local alignment search tool, eller EKSPLOSJON, og velg nukleotid BLAST verktøy for å sammenligne din sekvens til databasen. Skriv inn din sekvens i søket sekvens tekst-boksen, og velg den aktuelle databasen i rullemenyen. Til slutt, klikk BLAST-knappen på bunnen av siden, og vent til det verktøy for å få tilbake det som er mest lik sekvenser fra databasen.
I dette eksempelet, det øverste treffet B., subtilis belastning 168, viser 100% identitet med sekvensen i BLAST databasen. Hvis toppen traff ikke viser 100% identitet til forventet arter eller slekter, klikk på sekvensen som ligner mest på din søket for å se detaljer av justeringen. Justert nukleotider vil være sammen med korte vertikale linjer og avvikende nukleotider vil ha mellomrom mellom dem. Med fokus på de identifiserte feilaktige regioner, endre rekkefølge og gjenta BLAST søk hvis det er ønskelig.