La terra ospita milioni di specie batteriche, ognuna con caratteristiche uniche. Identificare queste specie è fondamentale nella valutazione dei campioni ambientali. I medici devono anche distinguere diverse specie batteriche per diagnosticare i pazienti infetti.
Per identificare i batteri, è possibile impiegare una varietà di tecniche, tra cui l’osservazione microscopica della morfologia o della crescita su un supporto specifico per osservare la morfologia delle colonie., L’analisi genetica, un’altra tecnica per identificare i batteri è cresciuta in popolarità negli ultimi anni, in parte a causa del sequenziamento del gene RNA ribosomiale 16S.
Il ribosoma batterico è un complesso di RNA proteico costituito da due subunità. La subunità 30S, la più piccola di queste due subunità, contiene 16S rRNA, che è codificato dal gene 16S rRNA contenuto all’interno del DNA genomico. Le regioni specifiche di 16S rRNA altamente sono conservate, dovuto la loro funzione essenziale nell’assemblea del ribosoma. Mentre altre regioni, meno critiche per funzionare, possono variare tra le specie batteriche., Le regioni variabili in 16S rRNA, possono servire come impronte molecolari uniche per le specie batteriche, permettendoci di distinguere i ceppi fenotipicamente identici.
Dopo aver ottenuto un campione di qualità di gDNA, può iniziare la PCR del gene di codifica rRNA 16S. La PCR è un metodo di biologia molecolare comunemente usato, costituito da cicli di denaturazione del modello di DNA a doppio filamento, ricottura di coppie di primer universali, che amplificano le regioni altamente conservate del gene e l’estensione dei primer da DNA polimerasi., Mentre alcuni primer amplificano la maggior parte del gene codificante 16S rRNA, altri solo amplificano frammenti di esso. Dopo la PCR, i prodotti possono essere analizzati tramite elettroforesi su gel di agarosio. Se l’amplificazione ha avuto successo, il gel dovrebbe contenere una singola banda di una dimensione prevista, a seconda della coppia di primer utilizzata, fino a 1500bp, la lunghezza approssimativa del gene 16S rRNA.
Dopo la purificazione e il sequenziamento, le sequenze ottenute possono quindi essere inserite nel database BLAST, dove possono essere confrontate con le sequenze rRNA di riferimento 16S., Poiché questo database restituisce corrispondenze basate sulla più alta somiglianza, ciò consente la conferma dell’identità dei batteri di interesse. In questo video, osserverai il sequenziamento del gene rRNA 16S, tra cui PCR, analisi e modifica della sequenza del DNA, assemblaggio della sequenza e ricerca nel database.
Quando si manipolano microrganismi, è essenziale seguire una buona pratica microbiologica, compreso l’uso di tecniche asettiche e l’uso di adeguati dispositivi di protezione individuale. Dopo aver eseguito un’appropriata valutazione del rischio per il microrganismo o il campione ambientale di interesse, ottenere una coltura di prova., In questo esempio, viene utilizzata una coltura pura di Bacillus subtilis.
Per iniziare, fai crescere il tuo microrganismo su un terreno adatto nelle condizioni appropriate. In questo esempio, Bacillus subtilis 168 viene coltivato in brodo LB durante la notte in un incubatore agitazione impostato a 200 rpm a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare un kit disponibile in commercio per isolare il DNA genomico o gDNA da 1,5 millilitri della coltura overnight B. subtilis.
Per verificare la qualità del DNA isolato, prima mescolare cinque microlitri del gDNA isolato con un microlitro di colorante di caricamento del gel di DNA. Quindi, caricare il campione su uno 0.,gel di agarosio all ‘ 8%, contenente reagente di colorazione del DNA, come SYBR safe o EtBr. Dopo questo, caricare uno standard di massa molecolare di un kilobase sul gel, ed eseguire l’elettroforesi fino a quando il colorante anteriore è di circa 0,5 centimetri dal fondo del gel. Una volta completata l’elettroforesi su gel, visualizzare il gel su un transilluminatore a luce blu. Il gDNA dovrebbe apparire come una banda spessa, superiore a 10 kilobase di dimensioni e avere sbavature minime.
Successivamente, per creare diluizioni seriali del gDNA, etichettare tre tubi per microcentrifuga come 10X, 100X e 1000X., Quindi, utilizzare una pipetta per erogare 90 microlitri di acqua distillata sterile in ciascuna delle provette. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione gDNA al tubo 10X. Pipettare l’intero volume su e giù per assicurarsi che la soluzione sia miscelata accuratamente. Quindi, rimuovere 10 microlitri della soluzione dal tubo 10X e trasferirlo nel tubo 100X. Mescolare la soluzione come descritto in precedenza. Infine, trasferire 10 microlitri della soluzione nel tubo 100X, nel tubo 1000X.
Per iniziare il protocollo PCR, scongelare i reagenti necessari sul ghiaccio. Quindi, preparare il master mix PCR., Poiché la DNA polimerasi è attiva a temperatura ambiente, la reazione impostata deve avvenire su ghiaccio. Aliquota 49 microlitri della master mix in ciascuna delle provette PCR. Quindi, aggiungere un microlitro di dima a ciascuna delle provette sperimentali e un microlitro di acqua sterile al tubo di controllo negativo, pipettando su e giù per mescolare. Successivamente, impostare la macchina PCR in base al programma descritto nella tabella. Posizionare i tubi nel termociclatore e avviare il programma.,
Una volta completato il programma, esaminare la qualità del prodotto tramite elettroforesi su gel di agarosio, come precedentemente dimostrato. Una reazione riuscita utilizzando il protocollo descritto dovrebbe produrre una singola banda di circa 1,5 kilobase. In questo esempio, il campione contenente gDNA diluito 100X ha prodotto il prodotto di altissima qualità. Successivamente, purificare il miglior prodotto PCR, in questo caso, il gDNA 100X, con un kit disponibile in commercio. Ora il prodotto PCR può essere inviato per il sequenziamento.
In questo esempio, il prodotto PCR viene sequenziato utilizzando primer forward e reverse., Pertanto, vengono generati due set di dati, ciascuno contenente una sequenza di DNA e un cromatogramma di DNA: uno per il primer anteriore e l’altro per il primer inverso. Innanzitutto, esaminare i cromatogrammi generati da ciascun primer. Un cromatogramma ideale dovrebbe avere picchi equidistanti con pochi o nessun segnale di fondo.
Se i cromatogrammi mostrano picchi doppi, possono essere stati presenti più modelli di DNA nei prodotti PCR e la sequenza deve essere scartata. Se i cromatogrammi contenevano picchi di colori diversi nella stessa posizione, il software di sequenziamento probabilmente ha chiamato erroneamente nucleotidi., Questo errore può essere identificato e corretto manualmente nel file di testo. La presenza di ampi picchi nel cromatogramma indica una perdita di risoluzione, che causa una contabilizzazione errata dei nucleotidi nelle regioni associate. Questo errore è difficile da correggere e i disallineamenti in uno qualsiasi dei passaggi successivi dovrebbero essere considerati inaffidabili. La scarsa qualità di lettura del cromatogramma, indicata dalla presenza di picchi multipli, di solito si verifica alle cinque estremità prime e alle tre estremità prime della sequenza. Alcuni programmi di sequenziamento rimuovono automaticamente queste sezioni di bassa qualità., Se la sequenza non è stata troncata automaticamente, identificare i frammenti di bassa qualità e rimuovere le rispettive basi dal file di testo.
Utilizzare un programma di assemblaggio del DNA per assemblare le due sequenze di primer in un’unica sequenza continua. Ricorda, le sequenze ottenute utilizzando primer avanti e indietro dovrebbero parzialmente sovrapporsi. Nel programma di assemblaggio del DNA, inserire le due sequenze in formato FASTA nella casella appropriata. Quindi, fare clic sul pulsante Invia e attendere che il programma restituisca i risultati.
Per visualizzare la sequenza assemblata, fare clic su Contigs nella scheda Risultati., Quindi, per visualizzare i dettagli dell’allineamento, selezionare Dettagli assemblaggio. Passare al sito web per lo strumento di ricerca di allineamento locale di base, o BLAST, e selezionare lo strumento BLAST nucleotide per confrontare la sequenza al database. Immettere la sequenza nella casella di testo Sequenza query e selezionare il database appropriato nel menu di scorrimento verso il basso. Infine, fare clic sul pulsante BLAST nella parte inferiore della pagina e attendere che lo strumento restituisca le sequenze più simili dal database.
In questo esempio, il colpo in alto è B., subtilis ceppo 168, mostrando 100% identità con la sequenza nel database BLAST. Se il colpo in alto non mostra il 100% di identità per la vostra specie o ceppo previsto, fare clic sulla sequenza che più si avvicina la query per vedere i dettagli dell’allineamento. I nucleotidi allineati saranno uniti da brevi linee verticali e i nucleotidi non corrispondenti avranno spazi tra di loro. Concentrandosi sulle regioni non corrispondenti identificate, rivedere la sequenza e ripetere la ricerca BLAST se lo si desidera.