Relazione struttura — funzione dei telomeri
Come già detto, in assenza di telomerasi, i telomeri diventano non funzionali, si accorciano con successive divisioni cellulari e termini cromosomici possono fondersi come conseguenza della de-protezione. Le fusioni dei telomeri sono il risultato di non-homologous-fine-joining (NHEJ) che è uno dei meccanismi prevalenti di una guarigione della rottura del doppio filo (DSB)., Il risultato di tali eventi potrebbe essere la creazione di cromosomi con più di un centromero, che probabilmente saranno raggruppati ai poli opposti durante la mitosi, con conseguente rottura del cromosoma e ulteriore instabilità genomica attraverso ripetuti eventi di rottura della fusione. Nei vertebrati, il ruolo della protezione dell’estremità del cromosoma per essere distinto dalle rotture del cromosoma è attribuito ad un complesso specifico delle proteine denominate collettivamente shelterin. Il complesso di Shelterin è composto basicamente da sei proteine., Due membri del complesso shelterin, TRF1 e TRF2 (da Telomeri Repeat-binding Factor 1 e 2) si legano direttamente alla sequenza telomerica a doppio filamento, mentre POT1 lega ssDNA. TRF2 interagisce con e recluta RAP1, mentre TIN2 media il legame TPP1-POT1 al complesso core TIRF1 / TIRF2. POT1 si lega e protegge la sporgenza del DNA a singolo filamento 3 dei telomeri (G-tail), mentre TIN2 collega probabilmente i complessi di legame del DNA a singolo e doppio filamento, specialmente nell’area della formazione del D-loop telomerico (figura 3) ., Sembra che questo nucleo shelterin complesso si trova principalmente alla fine telomeri (indicato anche come telosoma) e serve sia nella stabilizzazione t-loop struttura, proteggendolo allo stesso tempo da essere riconosciuto come danni al DNA e riparato da NHEJ. Inoltre, shelterin regola l’accesso ai processi di ripristino del DNA telomerico dopo ogni replicazione del genoma., In generale, il complesso shelterin sembra funzionare come una piattaforma che regola il reclutamento di un elenco crescente di fattori coinvolti nel rimodellamento della cromatina, nella replicazione del DNA, nella riparazione del danno al DNA, nella ricombinazione e nella funzione telomerasi, regolando così l’accesso / modifica dei telomeri da diversi processi cellulari (figura 4), recentemente recensito in .
Figura 3.
Modello schematico di potenziale telomero capping disposizione dal shelterin complesso., Le proteine del complesso shelterin partecipano alla protezione dei telomeri, alla replicazione e alla regolazione della lunghezza. Le proteine TRF1 e TRF2 si legano specificamente al DNA telomerico ds, mentre POT1 (TPP1) riconosce ssDNA (stabilizzante D-loop). TIN2 interconnette ssDNA a complessi leganti dsDNA, stabilizzando la struttura del telosoma. Il DNA telomerico consiste della sequenza ripetitiva del DNA, di una regione duplex e di una sporgenza del G-strand di ssDNA (G-strand, arancio; C-strand, blu). Il complesso di shelterin lega sia al duplex che alle regioni di ssDNA con le interazioni specifiche della proteina-DNA., La formazione del t-loop comporta l’invasione del filo dello sbalzo G per creare un loop di spostamento (D-loop). Il t-loop è proposto per mascherare l’estremità del cromosoma dai sensori di danno al DNA. Per motivi di semplicità il complesso shelterin è raffigurato come un complesso di sei proteine omogeneamente disperso sul telomero. Vedere il testo per ulteriori dettagli.
È interessante notare che, sembra che più di un tipo di nucleo shelterin complesso esiste e non tutti sono necessariamente parte del telosoma. Sono stati rilevati complessi contenenti solo TRF1-TIN2-TPP1-POT1 o TRF2-RAP1., Dati recenti che misurano le quantità assolute e relative di TRF1 e TRF2 nella cellula hanno rivelato che TRF2 è circa due volte più abbondante di TRF1 e ciò è coerente con il rilevamento di TRF2 in focolai indotti da danni al DNA diretti spazialmente in regioni cromosomiche non telomeriche. Il reclutamento di TRF2 nei siti di danno al DNA è coerente con il fatto che svolge un ruolo critico nella risposta al danno al DNA . La complessità della rete creata dal telosoma si basa praticamente sulle caratteristiche strutturali uniche dei membri shelterin., TRF1 e 2 hanno un dominio SAB / MYB con il quale entrambi riconoscono un motivo TTAGGGTTA sul DNA dei telomeri ds, una regione terminale ricca di acido (D/E) e un motivo di docking specifico denominato motivo di omologia TRF (TRFH). Il dominio TRFH media l’omodimerizzazione di TRF1 o TRF2 ma proibisce l’eterodimerizzazione a causa di vincoli strutturali . Un motivo FxLxP e un motivo Y / FxLxP sono necessari per la rilegatura TRF1 e TRF2, rispettivamente. Questi domini sono indicati come TRFH Binding Motifs (TBM). Il residuo aminoacidico Phe 142 nel motivo TRF1-TRFH è responsabile del legame TIN2 attraverso la sua regione TBM., TIN2-TBM ha un’affinità significativamente inferiore per la regione corrispondente di TRF2 (Phe 120) a causa di differenze strutturali nelle vicinanze di Phe 120 e infine è collegato a TRF2 tramite un’unica regione TRF2 vicino all’N-terminale della proteina. Tuttavia, il residuo di Phe 120 è cruciale per l’interazione specifica con altri fattori associati ai telomeri come Apollo nuclease, un partner di legame TRF2. La formazione complessa tra i membri del nucleo di shelterin e i fattori associati a motivi simili a TBM sono probabilmente diretti anche da cambiamenti nelle affinità di legame dovuti a modifiche post-traduzionali., Un bell’esempio è la parsilazione TRF1 da parte della tankirasi, con conseguente significativa diminuzione dell’affinità DNA-TRF1, consentendo l’allungamento dei telomeri e la separazione dei telomeri gemelli alleviando specificamente il complesso di coesione da TRF1 e TIN2 . Il disequilibrio di tali interazioni potrebbe essere dannoso per l’integrità del genoma come dimostrato dai livelli elevati di TIFS formati nelle cellule che sovraesprimono un TBM isolato come ripetizione tandem YRL. Analoghi risultati deleteri sono stati ottenuti esprimendo un allele di sostituzione TRF2-F120 .,
Recenti studi strutturali di una delle due pieghe OB (Oligonucleotide / oligosaccharide-binding) di S. pombe Pot1, che costituiscono il sito di legame di ssDNA, hanno rivelato che il riconoscimento nucleotidico non specifico di ssDNA è ottenuto da modalità di legame finora non identificate che compensano termodinamicamente le sostituzioni di base attraverso interazioni di impilamento alternate e nuove reti di legame H. Così, delineando in dettaglio la struttura dei membri shelterin e fattori associati si prevede di migliorare geometricamente la nostra comprensione delle reti consisteva e il modo in cui la quantità vs., i cambiamenti di qualità interferiscono con le modifiche strutturali che portano ad alterazioni funzionali, sintonizzando finemente la stabilità del genoma. Indubbiamente, la ricchezza di informazioni raccolte ha già aperto la strada all’uso di agenti anti-telomerasi negli studi clinici, con risultati attesi robusti.
Oltre a shelterin e partner interagenti, un altro complesso significativo è recentemente emerso per essere coinvolto anche nella biologia dei telomeri, il complesso CST. Il complesso CST è composto da CTC1, STN1 (OBFC1) e TEN1, ed è stato attribuito il salvataggio di fork di replica in fase di stallo durante lo stress di replica., Il complesso CST interconnette i telomeri alla replicazione e alla protezione del genoma indipendentemente dalla via Pot1 .
L’accumulo di prove da parte di numerose pubblicazioni ha dimostrato inaspettatamente che la risposta al danno del DNA (DDR) e i percorsi di riparazione, nonostante sembrino un paradosso, condividono caratteristiche comuni con le strategie di manutenzione dei telomeri. Le proteine a risposta precoce della DDR vengono reclutate nei telomeri e le proteine che si ritiene funzionino nel mantenimento dei telomeri sono state anche evidenziate come coinvolte nella DDR., Paradossalmente, i fattori DDR nei telomeri, in condizioni normali, sembrano interferire con il restauro dei telomeri e la conservazione della lunghezza. Questo fenomeno distinto è attribuito a shelterin coordinamento dei fattori DDR accesso e la funzione a telomeri. TRF2 può legarsi e sopprimere ATM, mentre POT1, quando legato alla G-coda attraverso TPP1, inibisce ATR. La soppressione di attività TRF2 suscita l’attivazione di ATM e di p53, piombo ai fuochi indotti disfunzione del telomero (TIFs). Il risultato di TIFs nelle fusioni end-to-end dei telomeri via la via di NHEJ ed il loro aspetto è correlato con l’induzione di senescenza ., L’interazione sembra essere basata sulla quantità di shelterin e sulla lunghezza dei telomeri, due parametri direttamente correlati tra loro, poiché quando i telomeri sono criticamente corti è meno probabile che formino un t-loop, una reazione catalizzata da TRF2 in vitro, e a sua volta meno shelterin è legato . Di conseguenza, due importanti strutture di manutenzione dei telomeri sono significativamente ridotte (t-loop e shelterin coating), consentendo l’attivazione della DDR., Ancora, abbastanza curiosamente, NHEJ la macchina può anche esercitare un ruolo protettivo a telomeri attraverso l’attività enzimatica di Tankyrase relative alla promozione della DNA-PKcs stabilità e la prevenzione della formazione dei telomeri sorella scambi tra cromatidi fratelli (T-Sce) come un prodotto di inter-telomeri ricombinazione
un Altro intrigante paradigma è il complesso MRN (un complesso di proteine di ricombinazione meiotica 11 (MRE11) – RAD50 e NBS1 proteine), in cui un singolo NBS1 molecola è associato con due dimeri di MRE11 e RAD50 ., Le proteine MRE11 e RAD50 formano un eterotetramero che contiene due domini di legame e di elaborazione del DNA in grado di colmare le estremità libere del DNA . Il complesso MRN si localizza ai telomeri durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare attraverso l’interazione diretta di NBS1 con TRF2, presumibilmente contribuendo alla formazione della G-coda sul filo telomerico principale e quindi alla stabilità dei telomeri ., Nell’uomo, la mutazione nel gene NBS1 porta al disturbo dell’instabilità cromosomica, alla sindrome da rottura di Nimega 1, associata ad una maggiore sensibilità alle radiazioni ionizzanti e all’instabilità cromosomica e al cancro in via di sviluppo precoce anche negli eterozigoti NBS1+/ -. NBS1 contiene un dominio associato a forkhead (FHA), un dominio BRCT (BRCA1 C Terminus), un dominio associato a MRE11 e un dominio interagente con ATM. L’accumulo di prove dimostra che NBS1 interagisce con i telomeri e contribuisce alla loro stabilità, almeno nelle cellule umane e di topo., Esperimenti di immuno-fluorescenza indiretta hanno rivelato che NBS1 co-localizza con TRF2 durante la fase S in cellule HELA coltivate, possibilmente modulando la formazione di t-loop. Poiché TRF2 è stato trovato anche su sequenze non telomeriche, l’impatto della co-localizzazione NBS1 con TRF2 richiede ulteriori chiarimenti. Similmente, in fibroblasti embrionali del topo, il reclutamento attivo di NBS1 ai telomeri disfunzionali è stato osservato . Il complesso MRN sembra svolgere un duplice ruolo nella biologia dei telomeri. Uno è quello di mediare, almeno in parte, la risposta ATM che porta alla formazione di TIF dopo la cancellazione di TRF2 ., In secondo luogo, per la sua attività nucleasica, è necessario per la normale formazione di telomeri, poiché l’MRN è implicato nella lavorazione di telomeri danneggiati influenzando la produzione della sporgenza da un telomero smussato creato dopo la replicazione dei telomeri . Tale accelerazione della formazione della G-coda, dopo la disfunzione / de-protezione del telomero impedisce la fusione dei fili smussati-finiti principali dei telomeri de-protetti durante la fase S. Apollo nuclease può anche essere reclutato ed essere coinvolto in questo processo., Interazione diretta di NBS1 con telomeri repeat-binding factor 1 (TRF1) è stato dimostrato per le cellule telomerasi negative immortalate implicando che questa interazione potrebbe essere coinvolto nell’allungamento alternativo dei telomeri. Inoltre, nelle cellule che esprimono telomerasi, il complesso MRN, attraverso la downregolazione e la rimozione di TRF1 (fosforilazione NBS1-dipendente di TRF1 da ATM) può anche promuovere l’accessibilità della telomerasi all’estremità 3 dei telomeri ., L’intercomunicazione di riparazione del DNA con la stabilità dei telomeri è una relazione stabilita abbastanza presto nell’evoluzione come indicato dal fatto che MRE11 e RAD50 insieme alle protein chinasi ATM e ATR, sono anche essenziali per una corretta manutenzione dei telomeri nelle piante .
Figura 4.
Fattori associati alla shelterina coinvolti anche nella risposta al danno al DNA., Dettagli nel testo
Recentemente, un’altra proteina fosfatasi, PNUTS (subunità di targeting nucleare della fosfatasi 1), che interagisce con TRF2, inserisce un altro pezzo nel puzzle della relazione DDR e telomeri . Inoltre, rilevato dalla ricerca a livello genomico di proteine contenenti TBM, il fattore DDR prossimale MCPH1 del cuscinetto a tre domini BRCT interagisce anche con TRF2. Le mutazioni MCPH1 sono associate a difetti dello sviluppo e aumento dell’incidenza del tumore ., Le cellule impoverite MCPH1 presentano livelli ridotti di BRCA1 e Chk1 e sono difettose nel checkpoint G2 / M .
Un ruolo essenziale nell’integrità dei telomeri è anche attribuito a BRCA2, un componente chiave della via di riparazione del DNA HR. BRCA2 si associa ai telomeri durante le fasi del ciclo cellulare S / G2 e sembra facilitare il carico della ricombinasi RAD51 . Pertanto, l’attività HR mediata da BRCA2 è necessaria per il mantenimento della lunghezza dei telomeri. Questi risultati possono spiegare, almeno in parte, i telomeri più brevi trovati nei tumori al seno umani mutati BRCA2., Pertanto, la disfunzione dei telomeri può anche essere implicata nell’instabilità genomica osservata nei tumori mammari e ovarici carenti di BRCA2 .
In totale, un certo numero di molecole di riparazione del DNA, che fanno collettivamente parte delle vie dell’anemia HR, NHEJ, NER e Fanconi, sono state reclutate nei telomeri, con TRF2 che funziona principalmente come hub proteico., In condizioni normali, la segnalazione ATM/ATR, al momento della de-protezione dovuta alla breve lunghezza dei telomeri e al successivo “ritiro” della cellula (senescenza / apoptosi) fa parte del normale meccanismo protettivo di iniziazione tumorale contro le cellule destabilizzate dal genoma. Nelle cellule con lunghezza normale del telomero ci sono relazioni inibitorie tra questi diversi sistemi di riparazione del DNA, impedendo l’attivazione reciproca.
I telomeri fanno parte della struttura dell’eterocromatina, il che significa che segnali specifici definiscono la loro posizione nel nucleo., Anche se il fatto che i telomeri dovrebbero essere per definizione estremità cromosomiche stabili e inerti, tuttavia sembrano essere complessi nucleoproteici dinamici coinvolti anche nel rimodellamento della cromatina. Il reclutamento della proteina legante l’eterocromatina HP1, la tri-metilazione arricchita dell’istone H3 lisina 9 (H3K9) e H4K20 , così come la metilazione dei dinucleotidi CpG nelle ripetizioni del DNA subtelomerico supportano questa nozione. Questi segni eterocromatici sono sostituiti da caratteristiche di cromatina aperta (aumento dell’acetilazione sulle code degli istoni, ecc.) quando i telomeri diventano più corti., Tali cambiamenti implicano che è necessaria una lunghezza minima del telomero per mantenere la conformazione simile all’eterocromatina alle estremità del cromosoma, una struttura che può cambiare in seguito all’attrito del telomero. Inoltre, i telomeri e il complesso shelterin dovrebbero allentare la loro struttura stretta durante la replicazione cromosomica e ristabilire la loro forma compatta dopo il completamento della duplicazione del DNA. Un analogo allentamento della struttura dei telomeri dovrebbe essere richiesto nei casi di ripristino dei telomeri mediante meccanismi di telomerasi o di riparazione del DNA, anche se possibilmente attraverso procedure distinte., Per ottenere questa plasticità, la cromatina deve essere rimodellata attraverso un numero di enzimi, secondo un codice istonico locale . Un certo numero di modifiche dell’istone sono implicate dove le interazioni distinte della coda-proteina dell’istone promuovono il rilassamento o la compressione della struttura complessa del telomero . Ad esempio, gli esperimenti di deplezione di SIRT6 (un istone H3K9 deacetilasi che modula la cromatina telomerica) mediante interferenza dell’RNA hanno fornito la prova di un aumento del danno al DNA nucleare e della formazione di focolai indotti dalla disfunzione dei telomeri., Questi esperimenti hanno suggerito che SIRT6 protegge le cellule endoteliali dai danni al telomero e al DNA genomico, prevenendo così una diminuzione della capacità replicativa e l’insorgenza di senescenza prematura, in questo caso particolare implicata nel mantenimento delle funzioni omeostatiche endoteliali e nel ritardo dell’invecchiamento vascolare.
Un altro importante insieme di fattori implicanti nella biologia dei telomeri sono i prodotti dei geni ATRX e DAXX, che sono implicati nel rimodellamento della cromatina insieme all’istone H3.3 ., Mutazioni o delezioni in questi loci genetici sono state direttamente correlate con lo stato ALT+ su linee cellulari o tumori di per sé . Secondo questi risultati, lo screening per mutazioni/espressione ATRX/DAXX può rappresentare il marker più affidabile per i tumori che hanno scelto la via ALT TMM.,
Collettivamente, è il corretto assemblaggio di shelterine nei telomeri che è essenziale per la stabilità del cromosoma (differenzia le estremità del cromosoma dalle rotture del DNA ds e previene la perdita di informazioni genetiche attraverso attacco nucleolitico (degradazione mediata dall’esonucleasi) o fusioni cromosomiche aberranti e ricombinazione indesiderabile, durante la durata della vita di una cellula., Insieme alla struttura adeguata, la coordinazione funzionale che controlla la TMM e l’attività della telomerasi sono strettamente regolate durante tutto il ciclo cellulare da una serie di fattori accessori implicati, reclutati transitoriamente dai complessi / sottocomplessi di shelterina .
Oltre al loro ruolo protettivo, la corretta interazione delle shelterine con i componenti dei macchinari per la riparazione del DNA, nonché i componenti della telomerasi e il reclutamento della telomerasi, consente il ripristino dei telomeri quando appropriato., L’importanza della corretta struttura-funzione dei componenti di shelterin nella biologia dei telomeri e nella formazione del cancro, insieme alle malattie associate ai telomeri, sono rappresentate dall’associazione del rilevamento delle mutazioni in TIN2 in molti di questi casi .