Osservazione
Gran parte dei progressi nella microbiologia è dipeso dallo studio delle “culture pure.”Queste sono culture che contengono un solo tipo di cellula, idealmente con la coltura derivata da una singola cellula iniziale., Dal primo sviluppo di metodi per stabilire culture pure (1), ci sono stati molti esempi in cui le culture inizialmente considerate pure sono state successivamente trovate per contenere due tipi di microbi. In alcuni casi, queste colture multispecie involontarie hanno portato a importanti scoperte, come la scoperta del trasferimento interspecie di idrogeno (2). Tuttavia, con l’avvento delle tecnologie di sequenziamento profondo, si potrebbe ragionevolmente prevedere che i contaminanti non rilevati nelle culture non sarebbero più una preoccupazione significativa.,
Il ceppo PCA di Geobacter sulfurreducens è stato isolato a metà degli anni 1990 utilizzando tecniche standard di arricchimento e isolamento che includevano la diluizione fino all’estinzione in mezzo liquido, seguita da ripetute striature di colonie isolate su terreno solidificato con agar (3). Questa è la strategia classica insegnata nei più popolari libri di testo introduttivi di microbiologia (4-6). Successivamente, il ceppo DL1 di G. sulfurreducens è stato ottenuto mediante ulteriore restringimento di colonie isolate di PCA (7). Con lo sviluppo di metodi per la manipolazione genetica di G. sulfurreducens (7) e il sequenziamento del suo genoma (8), G., sulfurreducens divenne la specie di Geobacter di scelta per lo studio della fisiologia e delle nuove proprietà di trasferimento di elettroni extracellulari di questo genere importante dal punto di vista ambientale (9). Il sequenziamento iniziale del gene rRNA 16S nella coltura (3), così come il sequenziamento del genoma prima a 8 volte (8) e poi a 80 volte (10, 11) copertura, ha indicato che la coltura conteneva un solo ceppo.,
Nel tentativo di evolvere adattivamente DL1 per produrre più corrente, è stato inoculato in un sistema bioelettrico con un anodo di grafite in bilico ad un potenziale (-400 mV contro Ag/AgCl) considerato vicino al limite inferiore al quale sarebbe possibile la generazione di corrente da acetato (12). Un isolato ottenuto dal biofilm dell’anodo, designato G., sulfurreducens ceppo KN400 (12), è superiore al ceppo inoculo nella produzione di corrente elettrica, e questa superiorità è attribuita almeno in parte alla sua capacità di produrre più “nanofili microbici”, filamenti proteici elettricamente conduttivi che presentano conduttività elettrica metallica (13, 14).
Inizialmente si presumeva che il ceppo KN400 avesse accumulato una o più mutazioni che ne aumentavano la capacità di trasferimento extracellulare di elettroni., Ciò sarebbe analogo alla selezione di ceppi mutanti durante l’evoluzione adattativa del ceppo DL1 per lo scambio di elettroni con altri organismi(11) o tassi più elevati di riduzione dell’ossido di Fe (III) (10). Tuttavia, la genomica comparativa ha rivelato che la sequenza genomica del ceppo KN400 conteneva più di 27.270 polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) (15). Un terzo dei geni aveva almeno un polimorfismo nucleotidico e un quarto aveva un polimorfismo che influenzava la sequenza proteica risultante (15). Basato su tassi di mutazione tipici di 6.,3 × 10-9 / bp per generazione (16), ci vorrebbero più di 1.000 anni per accumulare queste molte mutazioni nel ceppo DL1. Inoltre, non ci sono ortologhi nel ceppo DL1 per 139 dei fotogrammi di lettura aperti (ORFs) nel genoma del ceppo KN400, la maggior parte dei quali sono più strettamente correlati ai geni in organismi filogeneticamente diversi (15).
Queste considerazioni e il fatto che l’ORFs unico per KN400 non sono stati rilevati quando la coltura inoculo è stato risequenced (10, 11) ha portato all’ipotesi che KN400 è entrato nel sistema bioelettrochimico come contaminante., Per valutare questa possibilità, la purezza della coltura DL1 è stata ulteriormente valutata con sensibilità ancora più elevata.
Sia DL1 che KN400 contengono omcS, un gene per un citocromo di superficie esterna che ha una delle più alte proporzioni di SNPs (36 SNPs / kb) tra i due ceppi (15). Questo gene è stato amplificato dalla coltura DL1 che era stata utilizzata per inoculare il sistema bioelettrochimico e i prodotti PCR sono stati sequenziati con Illumina Hi-Seq 2000 (vedere il testo S1 nel materiale supplementare)., La sequenza KN400 è stata rilevata, indicando che KN400 era presente nell’inoculo iniziale utilizzato per lo studio di selezione degli anodi. Tuttavia, delle>107 sequenze di alta qualità recuperate, solo 286 erano sequenze KN400 contro 1,5 × 107 sequenze DL1 (Tabella 1).
Testo S1
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le Stime di ceppo KN400 abbondanza in vari culturesa
Tabella S1
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L’abbondanza relativa di KN400 ceppo in questa stessa cultura è stata ulteriormente valutata mediante PCR quantitativa (qPCR) con un set di primer specifici per il gene trovato solo in KN400 (vedi Testo S1 e Tabella S1 nel materiale supplementare) e un set di primer, che rileva sia KN400 e DL1 (vedi Tabella S1 nel materiale supplementare)., L’abbondanza relativa della sequenza specifica KN400 era simile a quella delle sequenze OMCS KN400 determinate dall’approccio di sequenziamento (Tabella 1). L’analisi della sequenza e il saggio qPCR della coltura PCA depositata presso ATCC hanno rivelato la presenza di KN400 a una simile bassa abbondanza (Tabella 1).
Abbiamo tentato di rimuovere il raro contaminante KN400 dalla coltura DL1 mediante ripetuti restringimenti di colonie isolate coltivate su terreno acetato-fumarato solidificato (7), ma il ceppo KN400 ha continuato a persistere a bassa frequenza nelle colonie isolate (Tabella 1)., Tuttavia, una coltura in cui KN400 non poteva più essere rilevata è stata ottenuta in mezzo acetato-fumarato liquido (vedere il testo S1 nel materiale supplementare) in cui la crescita più elevata di diluizione è stata sottoposta a diversi cicli successivi di diluizione seriale (Tabella 1). Ciò ha dimostrato che il ceppo DL1 non richiede la rara presenza di KN400 per crescere nel mezzo acetato-fumarato su cui questa coltura viene regolarmente mantenuta.
Quando KN400 puro e la coltura DL1 priva di KN400 sono stati inoculati in mezzo acetato-fumarato in quantità uguali, DL1 ha superato KN400 (Fig., 1 bis). Ciò è coerente con la scoperta che quando i due ceppi sono stati coltivati separatamente, DL1 è cresciuto molto più velocemente di KN400 (densità ottica a 600 nm di 0,04 per KN400 contro 0,65 per DL1 dopo 36 ore di incubazione; vedere Fig. S2 nel materiale supplementare) nello stesso mezzo. La percentuale di KN400 ha continuato a diminuire con trasferimenti consecutivi (1% inoculo) fino a quando l’abbondanza di KN400 è stata paragonabile a quella delle colture di stock PCA e DL1 (vedere il testo S1 nel materiale supplementare). KN400 persisteva a questo livello basso con ulteriori trasferimenti (Fig. 1 bis).,
Figura S2
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Crescita e attività del ceppo KN400 in diverse condizioni di crescita. (a) Abbondanza relativa di KN400 nei successivi trasferimenti a metà tronco (1% inoculo) di una coltura iniziata con proporzioni uguali di KN400 e DL1. I risultati sono i mezzi e le deviazioni standard delle colture triplicate. (b) Produzione corrente quando la coltura DL1 è stata introdotta nella camera anodica di un sistema bioelettrochimico con un anodo di grafite in bilico a -400 mV contro Ag/AgCl. La cultura senza KN400 non ha prodotto corrente in questo periodo., (c) Abbondanza relativa di KN400 nei biofilm anodici quando l’inoculo iniziale era la coltura DL1 successivamente trovata per contenere anche KN400. I risultati sono i mezzi e le deviazioni standard delle colture triplicate.
Ripetuti tentativi di far crescere la cultura DL1 senza KN400 su un anodo in bilico a -400 mV non hanno avuto successo. Tuttavia, la corrente è stata prontamente prodotta in un’altra serie di esperimenti in cui la coltura DL1 contenente KN400 fungeva da inoculo (Fig. 1 ter)., Un test qPCR del DNA estratto dal biofilm anodo ha indicato che il 100% delle sequenze omcS erano KN400 entro il secondo trasferimento (Fig. 1c). Questi risultati hanno suggerito che il motivo per cui KN400 è emerso sugli anodi era che il ceppo DL1 non era in grado di crescere nelle condizioni imposte. Senza questa insolita pressione selettiva, KN400 sarebbe rimasto inosservato nelle colture PCA e DL1 anche con metodi di sequenziamento di nuova generazione attualmente disponibili che possono teoricamente fornire una copertura di migliaia di volte nel sequenziamento del genoma.,
I fattori che contribuiscono alla persistenza a lungo termine del ceppo KN400 a frequenza estremamente bassa nella coltura DL1 rimangono un mistero. L’importanza di isolare fisicamente le singole cellule con metodi più definitivi rispetto alla striatura su terreno solido per stabilire colture pure è stata riconosciuta da qualche tempo (17), e metodi sempre più sofisticati per ottenere questo risultato continuano ad essere sviluppati (18-23)., Tuttavia, i metodi di placcatura che sono stati in uso per più di 100 anni e vengono insegnati a ogni studente di microbiologia come procedure standard per ottenere colture pure (4-6) rimangono i più comuni. I risultati presentati qui dimostrano che, senza isolamento unicellulare, i contaminanti criptici possono sopravvivere a bassissima frequenza nelle colture per decenni di indagini intensive e possono sfuggire al rilevamento anche con i metodi di sequenziamento più sofisticati attualmente disponibili.,
Figura S1
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